广泛而持续的抗生素压力下，细菌能够形成生物被膜来逃避抗生素和机体免疫系统的清除得以继续生存。本研究建立了大肠杆菌体外生物被膜模型，对249株临床分离大肠杆菌进行生物被膜形成能力的定量筛选和定性分析，并建立一种三明治结构的生物被膜渗透限制模型，研究ATCC25922成熟生物被膜对药物渗透限制的影响；同时对大肠杆菌耐药谱型、基因型与生物被膜表型之间的关系进行了研究，并比较不同抗生素压力下生物被膜耐药相关基因mRNA表达水平的变化，从基因水平上研究抗生素压力环境下大肠杆菌的生物被膜耐药机理。主要研究内容如下： ⑴大肠杆菌生物被膜体外模型的建立。以ATCC25922标准菌株为研究对象，从培养条件和细菌接种量等角度优化大肠杆菌生物被膜体外模型条件，并采用琼脂平板计数法对大肠杆菌浮游菌和生物被膜菌进行生长曲线的绘制。通过对不同成膜能力的大肠杆菌进行色氨酸定量实验，比较不同培养条件对生物被膜菌胞外基质的分泌的影响。结果表明在高渗透压、弱碱性和厌氧条件均能增加生物被膜生物的量，而不同稀释度的接种量对细菌生物被膜生物量的变化影响不显著(P>0.05)。 ⑵249株临床分离大肠杆菌生物被膜形成能力分析。采用改良结晶紫染色方法，对249株临床分离大肠杆菌进行生物被膜形成能力定量分析，同时进行快速银染法初步鉴定和扫描电镜确证分析。研究结果表明，249株大肠杆菌分为强成膜能力、中等成膜能力、弱成膜能力和无成膜能力四个表型，分别占3.21％，18.88％，51.81％和26.10％。 ⑶耐药谱型、基因型和生物被膜表型之间的关系研究。采用微量肉汤稀释法对249株大肠杆菌进行恩诺沙星等13种常用抗菌药物敏感性试验，利用WHONET5.3软件对实验数据进行统计处理，比较所分离的大肠杆菌对各种药物的耐药率并分析其与生物被膜表型之间的关系。同时采用Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR技术，建立基因指纹图谱，对64株临床分离大肠杆菌进行基因型分型，探讨大肠杆菌生物被膜形成能力与基因型的关系。实验结果表明，不同成膜能力大肠杆菌除了对安普霉素、阿米卡星、庆大霉素和头孢噻呋的耐药水平低于30.0％外，其余药物的耐药率均超过70.0％，且耐药谱主要集中在5—10耐之间。64株临床分离大肠杆菌ERIC-PCR指纹图谱聚类分析结果表明，在22.2％相似性的遗传基础上，64株大肠杆菌分为A，B，C和D四个型，强成膜能力菌株在各个型中均有分布，而中等成膜能力菌株主要分布在A型和C型，弱成膜能力菌株主要分布在B型和D型，无成膜能力菌株则主要分布在D型。 ⑷最小膜清除浓度(BBCs)的测定和渗透限制模型的建立。在亚抑菌浓度抗生素压力下，考察不同抗生素对临床分离敏感株大肠杆菌成膜能力的影响。同时，采用药物浓度梯度递增法对四株大肠杆菌进行药物诱导，比较在不同浓度的氨基糖苷类药物压力下，诱导前后菌株对不同抗菌药物对其最小抑菌浓度(MIC)和最小膜清除浓度(BBCs)的变化规律。结果表明利福平和头孢噻呋对菌株E25均表现出增强作用，阿米卡星对菌株E53表现出增强作用，阿莫西林对菌株E58表现出增强作用，而且随着药物浓度的增加，对生物被膜形成能力增强的作用逐渐增加。氨基糖苷类药物诱导菌株对八种抗菌药物的MIC和BBCs的值增加的倍数和诱导前相比至少增加8倍，BBCs值增加倍数比MIC增加的速率快。 ⑸生物被膜耐药相关基因的mRNA表达水平研究。对临床分离的敏感菌株分别进行氨基糖苷类药物和非氨基糖苷类药物的梯度递增诱导，利用实时荧光定量PCR技术对大肠杆菌生物被膜耐药相关基因的mRNA水平进行2 MIC、4 MIC和64 MIC三个药物浓度压力下表达差异分析比较，考察生物被膜耐药相关基因的表达水平变化规律。mRNA表达水平分析结果表明，不同成膜能力表型的大肠杆菌生物被膜相关基因表达水平表现出不同的变化趋势：在氨基糖苷类药物压力下，随着药物浓度的增加，各耐药基因大多表现出不同程度的表达减弱趋势，而在非氨基糖苷类药物压力下，各基因主要表现出表达增强的趋势。