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目的:食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,中国是食管癌的高发区,放疗是食管癌标准治疗方法之一,但放射抗性始终是限制放疗疗效提升的重要瓶颈。我们前期研究发现NRAGE可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与食管鳞癌放射抗性的形成。但这些研究都是建立在2D平面培养,无法真实模拟人体内肿瘤生长的微环境。3D细胞培养是一种模拟体内组织细胞立体生长的体外细胞培养技术,然而目前对于应用3D生物打印技术构建食管癌细胞模型的研究尚无报道。本研究借助3D细胞打印技术,以明胶、海藻酸钠和食管癌细胞混合物为打印材料,构建了可模拟体内肿瘤微环境的3D食管癌细胞模型,并与2D平面培养细胞模型比较,检测两种模式下,食管癌细胞增殖的情况。在两种培养模式下,研究过表达NRAGE对食管癌细胞增殖和放射抗性的作用。方法:1. 利用3D细胞打印技术,将人食管癌细胞/明胶/海藻酸钠构建3D食管癌细胞模型。2. 采用钙黄绿素-AM和碘化丙啶溶液对3D食管癌细胞模型进行活/死细胞双荧光染色,评价打印后细胞的存活率。3.显微镜下观察打印后1,7,14天的模型结构,并通过HE染色观察打印后7,14,21天3D食管癌细胞模型的细胞形态。4.扫描电镜观察打印后7,14天的3D细胞模型的生长状态。5.用Alamar Blue法检测食管癌细胞在2D培养和3D细胞模型中的增殖差异以及过表达NRAGE对不同水平培养的食管癌细胞增殖的影响。6.用上述方法分别建立Eca109和Eca109/NRAGE食管癌细胞3D模型,给予0Gy和10Gy照射,继续分组培养,至7,14,21天,免疫组化检测两种细胞ki-67、β-catenin、NRAGE的表达状况。7.Alamar Blue法检测2D平面培养和3D细胞模型中Eca109和Eca109/NRAGE食管癌细胞在接受10Gy照射前后增殖情况,并比较两者的差异。结果:1.成功构建3D食管癌细胞模型,打印参数:气压0.3 MPa,速度6mm/s,喷嘴0.26 mm,喷头温度18℃,平台温度6℃,打印模型呈立方体外形,内部结构为网格状,尺寸为8×8×1.4 mm~3,层厚0.28 mm,层高5层。2.3 D细胞模型中Eca109细胞组和Eca109/NRAGE细胞组的细胞存活率分别为0.7881±0.02306,0.8354±0.007338;P=0.0476。3. 构建的3D食管癌细胞模型,显微镜下观察与HE均显示打印的细胞分布均匀,且在第7天呈球形团块状生长,相对于亲本细胞Eca109,过表达NRAGE的Eca109/NRAGE细胞有明显的成团增长趋势。培养至14天和21天时,细胞团块继续增殖变大并形成简单的立体结构。在培养期间,天然明胶逐渐降解为肿瘤细胞的成团生长提供了空间。4. 扫描电镜显示,3D食管癌细胞支架培养第7天,两种细胞3D支架表面有凸起的圆形细胞球;培养第14天时,可见支架边缘细胞球表面有分泌物形成,且Eca109/NRAGE组较Eca109组细胞球表面分泌物多。5. Alamar Blue结果显示,2D培养环境下,Eca109和Eca109/NRAGE细胞,在培养的第一周内增殖速度快,一周后呈下降趋势;而3D细胞培养环境下,两种细胞初期增殖缓慢,随培养时间延长增殖速度加快呈上升趋势。Eca109/NRAGE食管癌细胞在两种培养环境中,均比Eca109细胞增殖速度快。6. 免疫组化结果显示,与亲本Eca109细胞3D模型相比,照射组和非照射组培养至第7,14,21天,过表达NRAGE的3D细胞模型ki-67、β-catenin、NRAGE表达均增高。7. Alamar Blue结果显示,无论2D细胞培养模型还是3D肿瘤细胞模型中,过表达NRAGE食管癌细胞在接受10Gy照射前后,均比亲本E ca109细胞增殖速度快。2D培养环境下,两种细胞在10Gy照射后的第7天增殖速度下降至最低点;而在3D细胞培养环境下,两种细胞在10Gy照射后的第11天增殖速度开始减慢,并且和非照射组比呈下降趋势。结论:1.通过3D生物打印技术以明胶和海藻酸钠为材料,可以建立3D食管癌细胞模型。2.与2D模型相比,3D培养的食管癌细胞形态已初具组织学特征,增殖规律可能更接近体内实际状态,提示3D模型在研究中的优势。3.3D食管癌细胞模型中,过表达NRAGE食管癌细胞较亲本Eca109细胞活力、增殖能力、ki-67、β-catenin、NRAGE表达、放射抗性均增强,同2D培养状态下的结果一致,进一步证实NRAGE通过Wnt/β-catenin通路影响食管癌细胞放射抗性的客观性。