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本次研究的耐热淀粉酶是一种特殊的淀粉改良剂,他们与一般的淀粉酶不同是,对可溶性淀粉、支链淀粉、β-环化糊精等多种底物都具有转糖基和降解作用,水解生成具有保健作用的麦芽糖或潘糖。本课题在已有耐热淀粉酶基因工程菌的基础上分别用乳糖和IPTG诱导来研究该酶的表达条件,然后研究酶的分离纯化与酶学性质,最后研究了温控型耐热淀粉酶基因工程菌的表达条件,为该酶的工业化应用打下了基础。1.论文首先对耐热淀粉酶基因工程菌培养条件进行了研究,该工程菌培养基经过优化分析后得到LB培养基为最佳表达培养基。其最佳表达条件:菌浓OD600为0.6、IPTG浓度达到0.6mmol/l、pH为6.0、诱导温度为37℃、诱导时间5h。2.其次,对耐热淀粉酶基因工程菌诱导剂组分进行了研究。在乳糖单独诱导时该重组耐热淀粉酶的最佳表达条件为乳糖浓度为0.5%(g/100ml),菌浓为3.0、诱导温度为37℃、诱导时间为5h、pH5.0,其酶活仅是IPTG单独诱导时酶活的10%,因此不能由乳糖来取代IPTG的诱导;乳糖与IPTG共同诱导麦芽糖基淀粉酶的最佳表达条件为乳糖浓度为0.5%(g/100ml)、IPTG浓度为0.2 mmol/l、菌浓为2.0、诱导温度为37℃、诱导时间为4h、pH7.0、其IPTG的用量是IPTG单独诱导时的1/3,酶活达到由单独IPTG诱导酶活的80%,因此IPTG与乳糖共同诱导可以取代由IPTG单独诱导。3.再次,对表达出来的重组耐热淀粉酶进行了分离纯化与酶学性质研究。通过重组耐热淀粉酶在基因表达是带有GST融合蛋白标签的特点,利用GST柱纯化了该重组酶,该纯化酶的活性很高,达到12000U/g,其分子量为90kDa。该重组酶的最佳反应温度为60～70℃,将该重组酶分别置于35℃和4℃保藏并定期取样测量酶的剩余活力,发现酶在35℃放置3天后其剩余活力为原来的50%;在4℃下,保藏2周后酶活下降一半。该重组酶最适pH 5.4～7.8,且pH值稳定性较好。该重组酶宽广的耐热性、较宽的pH稳定性为酶在工业上的应用打下了基础。4.论文的第四个研究内容是对该重组耐热淀粉酶的催化产物进行了研究。经过HPLC luna NH2柱检测发现耐热淀粉酶与以淀粉为底物以及与以β-环状糊精为底物进行催化反应所得产物均是麦芽糖和葡萄糖。对水解β-环状糊精的机理研究发现,该重组耐热淀粉酶是先打开β-环状糊精的环,然后以麦芽糖为一个单位进行水解,最后的产物为麦芽糖与葡萄糖,其比例为3:1;在耐热淀粉酶的应用上,将酶固定化后通过控制反应时间可以制备低聚糖;其与β-环状糊精葡聚糖转移酶协同反应降解淀粉时,两者的配比为:在耐热淀粉酶酶活的酶活为50U/ml,β-环状糊精葡聚糖转移酶酶活为2000U/ml时,体积比为2:1混合,反应温度为40-50℃,反应pH为7.0时与催化淀粉效果最好。5.论文最后优化了温控型耐热淀粉酶基因工程菌的表达条件。通过优化得出温控型耐热淀粉酶工程菌最佳表达条件为:发酵温度为30-32℃,pH6.0,菌浓为OD600为1.2,诱导温度为:38℃1h、39℃1h、40℃1h、41℃1h,诱导时间4h,其质粒稳定性维持在11代左右,酶活基本维持在4×104 U/g,与之前IPTG诱导型的重组酶活相近。该温控型重组酶最佳反应温度为55-60℃,热稳定性35℃,该酶在4℃下可以保存两周,35℃下可以耐受5d左右。最适反应pH6.6;pH稳定性6.6;K+对酶有很强的促进作用,其它金属离子对该酶有抑制作用;Km值0.14352mol/l。