目的:有研究证实神经心理应激(NPS)和环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)信号传导通路与某些恶性肿瘤的发生、发展密切相关,但NPS和CREB与非小细胞肺癌(NSCLC)的相关研究鲜有报道。本研究拟通过建立肺腺癌荷瘤裸鼠模型,观察NPS对肺腺癌荷瘤鼠肿瘤细胞生长和凋亡的影响,同时检测NPS刺激作用下肺腺癌荷瘤鼠血清和肿瘤组织中一些重要神经递质及受体的表达变化,研究NPS刺激作用下与CREB信号传导通路相关的某些关键信号因子表达状况,初步探讨NPS对NSCLC肿瘤细胞生长、凋亡以及血清和肿瘤组织中重要神经递质的影响,以及NPS对NCSLC中CREB信号传导通路的作用机制,为今后NSCLC治疗和预防提供新的策略和理论依据。材料与方法:选取雄性、6周龄、无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley Inc)64只,细胞株为人肺腺癌NCI-H441(浓度为3X106/0.2ml)。肺腺癌荷瘤裸鼠模型的建立:裸鼠腋窝皮下接种人肺腺癌NCI-H441细胞株0.2ml(浓度为3X106/0.2ml)。NPS暴露建立方法:每两天一次定期更换各个笼具中裸鼠组成,使更换后每个笼具中各只裸鼠来自更换前不同的笼具,避免各个裸鼠之间重复出现在同一笼具,造成裸鼠持续处于NPS状态。根据不同实验条件,把荷瘤裸鼠分为四个实验组、每组各16只;无NPS刺激组(CON组);有NPS刺激组(NPS组);NPS刺激同时应用NPS抑制剂(GABA)组(N+G组);应用NPS抑制剂GABA组但无NPS刺激(GABA组)。荷瘤裸鼠模型建立后NPS组和N+G组暴露于NPS条件下饲养四周,CON组和GABA组于正常条件下饲养四周。所有裸鼠均采用高压灭菌啮齿类动物专用饲料和无菌饮用水喂养。观察每组荷瘤裸鼠一般状态、肿瘤生长的体积及重量变化;肿瘤体积测量:肿瘤体积(mm3)=(长度/2)×(宽度2);四周后将实验动物脱颈处死,摘除眼球取血清,完整剥离移植瘤并称重;采用ELISA方法检测血清中肾上腺素、去甲肾上腺素、考地松及环磷酸腺苷(c AMP)的浓度(ng/ml);采用Tunnel方法测定移植瘤肿瘤细胞凋亡状况:采用原位细胞凋亡检测试剂盒,用荧光素标记;凋亡细胞判定标准:镜下见部分肿瘤细胞体积缩小,核质浓缩,核膜核仁破碎;凋亡细胞染色主要定位于细胞核,呈黄褐色,少量可见细胞浆弥散;凋亡指数(A1):=凋亡细胞数/(凋亡细胞数十正常细胞数)。Western blotting检测肿瘤组织中β1、β2肾上腺受体、烟碱型乙酰胆碱受体3、5、7(n ACh R3、5、7)、及CREB信号传导中通路CREB、磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白(p-CREB)、蛋白激酶A(PKA)的表达;结果应用Phoretix ID软件灰度扫描,其数值为相应蛋白与内参蛋白(GAPDH)相除得到的相对光密度值。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,四个实验组组间比较采用方差分析,组内两两比较采用q检验,百分率差异检验采用x2检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:(1)不同实验条件下移植瘤体积及重量:NPS组、CON组、N+G组和GABA组移植瘤体积分别为105.60±24.53mm3、80.21±21.84mm3、65.02±17.96mm3、49.61±15.74 mm 3,四组比较差异有统计学意义(P=0.031),NPS组体积明显大于CON、N+G和GABA组(P=0.046,P=0.039,P=0.021,P=0.008);NPS组、CON组、N+G组、GABA组移植瘤的重量分别为0.17±0.09g、0.12±0.10g、0.11±0.06g、0.10±0.07g,四组重量明显不同且差异有统计学意义(P=0.011):NPS组重量明显大于CON、N+G、GABA组(P=0.027,P=0.023,P=0.003)。(2)不同实验条件下肺腺癌荷瘤鼠血清中神经递质的表达:肾上腺素浓度在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为2.37±0.72 ng/ml、1.96±0.84 ng/ml、1.83±1.07 ng/ml、1.20±0.58 ng/ml,四组比较差异无统计学意义(P=0.344)。去甲肾上腺素浓度在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为15.61±3.94ng/ml、9.98±1.76ng/ml、10.28±2.41ng/ml、8.00±1.21ng/ml,四组相比NPS组浓度增高且具有统计学意义(P=0.026),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组比较浓度明显增高(P=0.026,P=0.015,P=0.011)。考地松浓度在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为5.71±0.94ng/ml、4.03±1.20ng/ml、3.20±0.83 ng/ml、2.63±0.58ng/ml,四组数值差异明显且有统计学意义(P=0.000),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组比较浓度明显增高(P=0.001,P=0.000,P=0.000)。环磷酸腺苷浓度在NPS组、CON组、N+G组、GABA组分别为29.56±3.90ng/ml、4.75±1.06ng/ml、14.31±2.50ng/ml、10.71±2.74ng/ml,各组之间相比具有统计学意义(P=0.003),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组相比浓度明显增高(P=0.000,P=0.020,P=0.009)。(3)不同实验条件下肺腺癌荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡:NPS组移植瘤组织中细胞凋亡率为26.2%;N+G组凋亡率为52.4%;GABA组凋亡率为58.6%;CON组凋亡率为41.8%。四组凋亡率比较差异明显且有统计学意义(P=0.028);NPS组细胞凋亡率明显低于CON组、N+G组、GABA组(P=0.034,P=0.021,P=0.026)。(4)Western blotting检测不同实验条件下肺腺癌荷瘤鼠β1、2肾上腺受体、n ACh R3、5、7及CREB、p-CREB和PKA的表达结果:移植瘤肿瘤组织中β1肾上腺受体的表达在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为0.54±0.28、0.26±0.14、0.27±0.11、0.20±0.14,四组差异具有明显的统计学意义(P=0.004),NPS组与CON组、N+G组、GABA组相比β1肾上腺受体表达明显增高(P=0.003,P=0.005,P=0.001)。移植瘤肿瘤组织中β2肾上腺受体的表达在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为0.83±0.33、0.378±0.17、0.41±0.19、0.38±0.15,四组比较差异明显(P=0.001),NPS组与CON组、N+G组、GABA组相比表达明显增高(P=0.001,P=0.002,P=0.001)。CREB蛋白表达在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为0.39±0.09、0.31±0.20、0.36±0.11、0.32±0.18,四组比较差异无统计学意义(P=0.971)。P-CREB蛋白表达在NPS、CON、N+G、GABA组分别为0.39±0.17、0.21±0.11、0.16±0.08、0.09±0.06,四组比较有明显差异且有统计学意义(P=0.011),NPS组P-CREB水平与CON组、N+G组、GABA组比较表达明显增高(P=0.043,P=0.013,P=0.001)。PKA蛋白表达在NPS、CON、N+G、GABA组分别为0.73±0.32、0.17±0.06、0.28±0.16、0.19±0.10,有显著的统计学差异(P=0.042),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组比较表达明显增高(P=0.010,P=0.034,P=0.026)。n ACh R3蛋白表达在NPS组、CON组、N+G组和GABA组分别为0.27±0.11、0.15±0.06、0.17±0.05、0.10±0.03,差异无统计学意义(P=0.344)。n ACh R5蛋白在NPS、CON、N+G、GABA组分别为0.39±0.12、0.17±0.07、0.17±0.06、0.08±0.05,四组比较有明显差异(P=0.014),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组比较表达明显增高(P=0.026,P=0.024,P=0.002)。n ACh R7蛋白在NPS、CON、N+G、GABA组分别为0.32±0.11、0.08±0.01、0.03±0.02、0.12±0.10,四组之间差异明显,有统计学意义(P=0.019),NPS组分别与CON组、N+G组、GABA组比较表达明显增高(P=0.013,P=0.003,P=0.035)。结论:神经心理应激可促进肺腺癌荷瘤裸鼠肿瘤的生长、增殖及抑制肿瘤细胞的凋亡,同时可引起肺腺癌荷瘤鼠血清中神经递质去甲肾上腺素、考地松的释放以及部分β肾上腺素能受体和乙酰胆碱受体明显增高;神经心理应激对肺腺癌荷瘤裸鼠肿瘤的影响与神经递质释放和激活CREB信号通路相关;抑制性神经递质γ氨基丁酸能够抑制NPS引起的神经递质(去甲肾上腺素、考地松)的释放、β肾上腺素能受体和乙酰胆碱受体的表达并影响肺腺癌荷瘤裸鼠肿瘤的生长及增殖。