普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是一种解支酶，能够专一性切开普鲁兰糖、可溶性淀粉、支链淀粉和一些寡聚糖中的α-1，6-糖苷键，应用于淀粉加工工业中，可极大提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶既可以单独使用，亦可与其它酶配合使用以收到良好的效果。目前已广泛地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和啤酒生产中。本实验研究了来源于地衣芽孢杆菌Bacillu.licheniformis(ATCC14580)普鲁兰酶基因amyX的克隆及其在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达。　　 革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌Bacillu.subtilis是一种(generall.recognize.a.safe)GRAS无内毒素的有机体，分泌能力强，能将目标蛋白直接分泌到培养基中，使得蛋白纯化更容易。因此，在胞内形成的包涵体就会减少，产生更多折叠正确、有活性的酶，且无密码子偏好性。因此，Bacillu.subtilis已经成为发酵工业中优选的表达菌株。　　 但枯草芽孢杆菌表达系统也有其局限性，质粒在复制时经常出现不稳定的单链(ssDNA)形式，从而导致质粒载体的丢失。复制过程中的某些环节对结构的重排表现得比较敏感，因此这种变化经常发生在重组的质粒中。避免质粒不稳定性的有效途径之一是使用整合质粒，整合载体的构成常包括(1)ori，大肠杆菌质粒复制起点(通常为pBR322或其衍生质粒)，在枯草芽孢杆菌中不发挥作用；(2)bla，编码β-内酰胺酶的氨苄抗性基因；(3)abr，枯草芽孢杆.的抗性选择基因；(4)一两段与枯草芽孢杆菌基因组具有一定同源性的序列。20世纪90年代后，整合载体的研究主要集中于构建基因敲除突变体、增大目标基因量、染色体步移、融合报告基因等。本实验重点研究了枯草芽孢杆菌遗传背景的改造，成功将巯基一二硫键氧化还原酶基因整合到枯草芽孢杆菌基因组上。　　 具体的研究结果和结论如下：　　 (1)普鲁兰酶基因amyX的克隆　　 本研究以Bacillu.licheniformis(ATCC14580)基因组为模板，根据数据库(SUBTILIST)已知的序列设计引物，成功克隆出了普鲁兰酶基因amyX，序列测定结果与已知序列完全一致。　　 (2)普鲁兰酶基因amyX在枯草芽孢杆菌野生型菌株B.su.168和改造的菌株WB700中表达　　 先将普鲁兰酶基因amyX克隆到含有一个强启动子的载体pACC上，然后与枯草芽孢杆菌中的质粒pUB110连接，最后转化枯草芽孢杆菌，经过SDS-PAGE和质谱鉴定，结果表明普鲁兰酶基因amyX在枯草芽孢杆菌野生型菌株B.su.168和改造的菌株WB700中成功表达。　　 (3)同源重组整合载体的构建　　 在大肠杆菌高拷贝质粒pBluescrip.I.KS(+)的多克隆位点插入了Cm抗性基因cat及其两端的同向重复序列FRT，改造好的载体命名为pBSK-p1p4-Cm。　　 根据整合到基因组上的目的基因来源，分别构建了两种整合方式的载体，即单交换整合载体和双交换整合载体。对于枯草芽孢杆菌本身来源的巯基-二硫键氧化还原酶基因bdbC，bdbD，直接将其作为同源片断，由于bdbC，bdbD共用一个启动子，在基因组上以操纵子的形式存在，因此构建的单交换载体命名为pACC-BdbDC。对于大肠杆菌来源的巯基-二硫键氧化还原酶基因ds.C，dsbD，dsbE，dsbG，则需要在枯草芽孢杆菌基因组上选择整合位点，在其整合位点附近各选取500bp基因作为同源片断，克隆到pBSK-p1p4-Cm上，构建了基因敲除载体。再将dsbC，dsbD，dsbE，dsbG插入到该载体的两个同源片断之间，分别构建了双交换载体pDGC和pDsbE。　　 (4)枯草芽孢杆菌基因组的改造　　 将以上构建好的单交换和双交换载体分别转化枯草芽孢杆菌B.su.168，结果巯基-二硫键氧化还原酶基因整合到枯草芽孢杆菌基因组上，成功改造了枯草芽孢杆菌遗传背景。