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捻转血矛线虫是一种高致病性的寄生在小反刍动物皱胃上的食血性寄生虫,可引起捻转血矛线虫病。主要临床症状包括贫血、营养不良、渐进性消瘦、腹泻甚至死亡。已有的流行病学调查显示,捻转血矛线虫病呈世界性分布,在全世界范围给养殖业造成了巨大的经济损失。目前,对捻转血矛线虫病的防控仍以药物防控为主,然而长期过度使用抗虫药已经造成虫体抗药性的产生以及动物产品、环境药物残留等问题,这种情况下高效抗捻转血矛线虫疫苗的研发变得至关重要。捻转血矛线虫的天然H11抗原能够提供足够的免疫保护,但是在细菌、酵母、昆虫细胞和秀丽隐杆线虫等表达系统中表达的重组形式却远远没有那么有效。研究表明,H11是一种完整膜糖蛋白复合物,有较高程度的糖基化修饰,H11的免疫保护性跟糖基化的修饰息息相关。而CHO细胞表达系统具有完善的翻译后修饰功能,特别是糖基化修饰,因此H11蛋白非常适合CHO细胞进行蛋白表达。另外近几年关于CAP蛋白超家族的研究日益增多,各种研究表明对于线虫感染有很强的免疫保护力。本研究选择lg K和GL作为蛋白表达的信号肽,首先从贴壁CHO细胞进行Hc-H11-2和Hc-cap-35基因的蛋白表达,后来再转入无血清悬浮CHO细胞的蛋白表达上。之后又进行了Hc-cap-35、Hc-cap-37和Hc-cap-45基因的原核表达,最终将两类重组蛋白进行动物试验,研究其免疫保护效果。(1)信号肽的分泌表达检测以及Hc-H11-2和Hc-cap-35基因在贴壁CHO细胞中的蛋白表达根据相关研究报道,选择lg K和GL作为蛋白表达的信号肽,加入His标签有利于蛋白纯化,构建到pc DNA3.1(+)真核表达载体上,在贴壁CHO细胞中进行Hc-H11-2和Hc-cap-35基因的表达。Western blot检测结果显示两个目的基因都能够成功表达,并且lg K信号肽能够显著促进目的蛋白的分泌表达能力。(2)Hc-H11-2和Hc-cap-35基因在悬浮CHO细胞中的蛋白表达由于瞬时转染,贴壁CHO细胞培养不能够产生足够的重组蛋白进行动物试验,因此转入到悬浮CHO细胞蛋白表达的研究上。根据上一步的研究结果,选择加入lg K信号肽的表达载体进行转染,从培养基中能够成功纯化出3mg左右的Hc-H11-2蛋白,没有获得足够的Hc-CAP-35蛋白进行动物试验。(3)Hc-cap-35、Hc-cap-37和Hc-cap-45基因的原核表达根据报道3个目的基因都有信号肽,去掉信号肽,加入His标签构建到p Esumo原核表达载体上进行原核表达,从上清中分别能够纯化出2mg左右的原核蛋白进行接下来的动物试验。(4)真核和原核重组蛋白的免疫保护性研究将CHO-H11-2和sumo-CAP-35、sumo-CAP-37、sumo-CAP-45重组蛋白一起进行动物试验。采用免疫CHO-H11-2蛋白200μg,混合免疫sumo-CAP-35、sumo-CAP-37、sumo-CAP-45蛋白300μg,使用Quil A免疫佐剂、皮下注射、分别免疫三次、免疫间隔两周的免疫程序。以免疫佐剂组作为对照组,感染i L3期幼虫5000条,感染35天后人道处死山羊,取皱胃进行成虫计数分析。结果表明注射CHO-H11-2蛋白免疫组可获得减卵率和减虫率分别为67.1%和63.5%的免疫保护效果。混合注射sumo-CAP-35、sumo-CAP-37和sumo-CAP-45蛋白免疫组可获得减卵率和减虫率分别为41.3%和70.1%的免疫效果。Elisa检测血清抗体水平,两个试验组免疫后Ig G抗体水平一直保持较高水平,可能对抗山羊感染捻转血矛线虫起到重要的保护作用,两个蛋白免疫组都取得了较好的免疫保护效果。本研究首次在悬浮CHO细胞蛋白表达系统上获得了CHO-H11-2重组蛋白,首次克隆表达了sumo-CAP-35、sumo-CAP-37、sumo-CAP-45重组蛋白进行动物试验。两类重组蛋白都取得了较好的免疫保护效果,CHO-H11-2重组蛋白的免疫效果更好,可能跟蛋白的糖基化修饰有关。这些结果为捻转血矛线虫疫苗的进一步开发提供了有价值的信息。