研究内容一99mTc间接标记Endostatin作为仁素受体显像剂的实验研究　　2005年9月，国家食品药品监督管理局(Chinas State Food and DrugAdmini strati on，SFDA)批准了世界首例内源性血管内皮抑制剂—恩度(商品英文名Endostar)为生物制品第一类抗肿瘤新药，其有效成分血管内皮抑素(Endostatin)通过与内皮细胞表面的血管生成标志物—核仁素(Nucleolin，C23)结合并内化至细胞核抑制内皮细胞迁移、增生[1]。Endostatin对成年动物和人的正常组织已建立的血管系统无干扰，同时由于其作用于遗传稳定的血管内皮细胞，不直接作用于肿瘤细胞，因而不会产生肿瘤的抗药性。恩度临床使用较安全，与化疗联合不增加毒副作用。　　恩度特异性针对肿瘤血管内皮细胞，靶向明确，但是恩度以及许多其他血管内皮抑制因子药物面临的一个共同的问题是:患者对药物敏感性不同导致有效率较低，以致延误治疗时机、增加患者负担等[2]。药物敏感性不同产生的根本原因在于病患组织的药物受体表达量不同，所以如何诊断受体含量从而指导个性化治疗意义重大。　　本研究通过建立核仁素表达水平不同的细胞模型和动物肿瘤模型用于评价99mTc标记的Endostatin作为核仁素受体显像剂的可行性，旨在建立一种诊断药物敏感性的方法，指导个性化用药，改变诊断性治疗的盲目性，提高药物有效率。　　本研究完成了以下工作:实现了以DTPA为螯合剂99mTc间接标记Endostatin，纯化产物放化纯达到90％以上;建立了核仁素受体表达量高、中、低的HMEC细胞株以及基因沉默核仁素表达作为阴性对照组的HMEC细胞株;通过99mTc-DTPA-Endostatin细胞亲和实验评价了量效关系，将平衡解离常数(KD)y值与核仁素表达量相对值x值之间的关联模拟为幂函数关系，y=14.049x-1.511(R2=0.9345);最后通过解剖分析了99mTc-DTPA-Endostatin在非小细胞肺腺癌动物模型体内的生物分布，注射1-4小时内放射性药物主要聚集在肾，其次是心脏;在肿瘤部位的分布始终在0.05％ID/g左右，未见不同时间点的分布有明显差异。　　结论:99mTc-DTPA-Endostatin对核仁素的结合能力与核仁素的表达量之间模拟为幂函数关系，指数为负值，故而表现为:随着核仁素表达量的升高，亲和常数变化的敏感性反而降低（见研究结果，图12）;体内实验结果显示放射性药物在非小细胞肺癌模型肿瘤部位无特异性聚集;未发现99mTc-DTPA-Endostatin有成为核仁素受体显像药物的开发前景。　　研究内容二肿瘤抑素T7肽及其衍生物作为整合素αvβ3受体显像剂的实验研究　　整合素αvβ3受体在恶性肿瘤的新生血管生成过程中起着重要的作用，高度特异性表达以及应用肿瘤类型广谱，使其成为可用于肿瘤诊断和治疗的非常有吸引力的靶点。T7肽是来源于Ⅳ型胶原蛋白的25肽，通过非RGD依赖模式与αvβ3特异结合并抑制肿瘤新生血管生成。T7免疫原性低，结合位点明确，是一个非常有潜力的活性探针。T7肽序列为Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu(TMPFLFCNVNDVCNTASRNDYSYWL)。已有文献报道T7抗血管生成的活性氨基酸位点为Leu78、Va182和Asp84[1]。　　本研究通过计算机分子模拟手段分析T7与整合素αvβ3受体的结合特异性并将其结合活性位点定位于Ser90、Arg91、Asp93和Tyr94。并在此基础上进一步设计保留活性位点的标记方法，以羰基锝法实现99mTc标记T7肽，进行了细胞水平的受体配体亲和力实验和动物体内生物分布实验。检测标记物在C6脑胶质瘤模型鼠和人非小细胞肺腺癌裸鼠模型体内的生物分布、靶/非靶分布比值等性质。　　本项目探索将T7肽用于肿瘤放射诊断和治疗的可行性。结果显示，99mTc对T7肽和T7-6H肽的标记产物产率高，不需进一步纯化放化纯即可达到90％以上，体外稳定性良好;细胞亲和力实验结果显示平衡解离常数在76.3-277.8nM范围内，以99mTc-T7-6H对C6细胞亲和力为最佳;生物分布数据显示两种标记物在肿瘤模型动物体内分布无显著差异，肺部有一过性聚集，该特征揭示将其用于肺部肿瘤的诊断显像或者治疗的可能性值得更深入研究。　　核医学是转化医学所需的重要手段。本研究的意义在于:能作为几乎所有实体瘤血管增生的诊断和治疗药物;能与现有的RGD衍生物诊断试剂共同作用而靶点不冲突;能用于评价治疗方案的有效性和判断预后，有助于治疗方案的选择;指导抗肿瘤血管生成药物的药理研究。