论文部分内容阅读
根结线虫(Root-knot nematode)是一类重要的植物寄生线虫(Plant-parasitic nematode),每年都给农业生产造成巨大的经济损失。根结线虫生活周期的大多数时间都寄生于植物的根内部,因此传统防治植物根结线虫的方法都存在不同程度的限制。文献报道,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)晶体蛋白Cry6A和Cry5B对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有杀虫活性,并且cry6A和cry5B单一基因转基因番茄对南方根结线虫取得了很好的防治效果。但目前报道的杀根结线虫Cry蛋白基因还很少,发掘新的杀根结线虫cry基因或者探索控制根结线虫的新策略具有很大的应用价值。因此,本研究开展了如下工作。1.土壤中的根结线虫大多是混合群体存在,本研究从侵染番茄根的根结线虫种群中分离并鉴定得到纯种根结线虫——南方根结线虫。这样为进一步深入的研究获得了可靠而充足的实验材料。2.本研究利用生物信息学分析了晶体蛋白Cry6A、Cry5Ba和Cry55Aa的结构,三蛋白在进化关系和保守区段上存在明显的不同。三维结构模拟的结果分析,蛋白Cry6Aa没有得到模拟结构,但蛋白Cry5Ba和Cry55Aa模拟的三维结构存在明显的差异。蛋白Cry6Aa、Cry5Ba和Cry55Aa与南方根结线虫总蛋白Ligand blot结果显示,三蛋白与南方根结线虫总蛋白的杂交信号存在明显的差异。3.本研究改进了苏云金芽胞杆菌晶体蛋白作用根结线虫生物活性测定的方法。在没有添加纯化晶体蛋白Cry5Ba的情况下,本研究在生物测定体系中添加1.0μg/mL间苯二酚和2.5μg/mL制霉菌素,研究证实二者组合对南方根结线虫的影响和对照相比较没有显著性差异。接着,本研究在改进的生测体系中添加纯化晶体蛋白Cry5Ba,并以20μg/mL BSA作为对照,三次生测结果的重复性和稳定性都很好,证明改进的生测方法是可行的。4.本研究从重组菌株BMB0250、BMB0215和BMB0224中纯化晶体蛋白Cry6Aa、Cry5Ba和Cry55Aa,并设置了不同的配比组合。生物活性测定分析显示,蛋白Cry6Aa/Cry5Ba和Cry6Aa/Cry55Aa组合的不同配比对南方根结线虫实验得到的半致死浓度(LC50)都小于理论计算得到的LC50,并依据协同系数(SF)大于1,本研究确定蛋白Cry6Aa/Cry5Ba和Cry6Aa/Cry55Aa对南方根结线虫活性作用存在明显的协同增效作用；蛋白Cry6Aa/Cry5Ba/Cry55Aa在1：1：1配比时对南方根结线虫活性也存在协同增效作用。然而,蛋白Cry5Ba/Cry55Aa组合不同配比对南方根结线虫的活性作用表现为剂量关系。另外,研究还发现,蛋白Cry6Aa/Cry5Ba和蛋白Cry6Aa/Cry55Aa在1：1配比时对南方根结线虫活性作用达到最大,且蛋白Cry6Aa/Cry55Aa的组合毒力效果更好。本研究证明了Cry6Aa/Cry5Ba和Cry6Aa/Cry55Aa组合对南方根结线虫具有明显的协同增效作用,这样就为二价转基因提供理论依据,而且本研究也为延缓根结根结线虫对单一毒素蛋白抗性的出现提出了新的策略。