宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,百余年的实践证明：手术仍是宫颈癌的主要治疗手段。传统的广泛性子宫切除术(radical hysterectomy, RH)是治疗早期宫颈癌的标准术式,取得了很好的临床疗效,但术后并发症(下尿道/膀胱功能障碍、肛门/直肠功能障碍、外阴/阴道功能障碍等)成为临床棘手问题。随着宫颈癌患者的日趋年轻化及术后生存率的提高,改善患者术后生活质量已成为现代宫颈癌治疗的发展趋势。结合文献及本课题组的前期研究发现：术中对盆腔自主神经(pelvic autonomic nerve, PAN)的损伤是导致上述术后并发症的主要原因。因此系统保留盆腔自主神经的广泛性子宫切除术(Systematic Nerve-sparing Radical Hysterectomy, SNSRH)逐渐成为妇科肿瘤专家研究的焦点。但该术式因基础解剖不明确、术中神经辨认困难、术后保留神经无量化标准及疗效不能全面评估等原因未能在临床上广泛应用。前期研究已证实RH术中损伤PAN的步骤主要为以下三个方面：(1)在贴近盆后壁切除骶子宫韧带(uterosacral ligament, USL)时损伤腹下神经；(2)靠近盆侧壁切除子宫主韧带(cardinal ligament, CL)时损伤盆腔内脏神经；(3)切除膀胱宫颈阴道韧带(vesico-cervical-vaginal ligament, VCVL)深层及阴道旁组织时损伤下腹下神经丛远端的膀胱神经支。本课题组前期已对主韧带及阴道旁组织复合体中的精细显微结构进行了定性定量研究。随着保留盆腔自主神经的广泛性子宫切除术术式的开展与改良,人们逐渐认识到骶子宫韧带在SNSRH中的重要性。少数学者对USL中的神经成份进行了精细解剖,认为骶韧带中含有较多神经纤维,包括交感神经、副交感神经、感觉神经和感觉/运动神经类型,USL深层的神经含量较浅层多。但研究不够全面、深入,特别是缺乏对宫颈癌转移复发相关的脉管成份的研究。然而对组织功能的认识是建立在对基本组织结构的充分认识之上的,因此,有必要对USL中的精细组织结构进行更为详细的定性定量研究,根据USL定性定量研究的精细解剖学特征,构建出USL中显微组织成份的分布图,以便为SNSRH手术中USL的正确处理提供更直观的组织学依据。本研究拟通过对RH术后切除的骶子宫韧带进行定性、定量研究,找出：1、骶子宫韧带中精细显微结构的性质；2、骶子宫韧带中血管、淋巴及神经的分布规律；3、根据USL中重要组织的分布特点,构建出骶子宫韧带精细解剖的分布图。最终目的是对骶子宫韧带中各种组织结构特点尤其是交感神经、副交感神经、血管、淋巴管的分布规律进行更直观的评估并阐明其相互空间结构。本研究分为两部分进行,具体如下：第一部分：骶子宫韧带精细显微组织结构的定性研究[目的]观察骶子宫韧带中精细显微结构成分,了解各组织结构的特征。[方法]收集15例广泛性子宫切除术术后新鲜骶子宫韧带标本29条(其中1条因增厚明显疑癌侵犯未纳入研究,术后经病理证实无肿瘤侵犯),每条USL标本自宫颈附着处由里向外以1cm间距切分为3段,命名为近段、中段及远段,近段、中段各1cm,其余为远段,共87块组织,每块组织经10%福尔马林固定、常规石蜡包埋、切片后采用HE染色、多种特殊染色及免疫组化染色法对其精细显微结构成分进行定性研究。[结果]1、HE染色：USL近、中、远各段的基本组织结构相似,含有大量纤维结缔组织、脂肪组织,丰富的神经纤维、血管(包括中、小、微动静脉),血管多与神经伴行,可见较多的淋巴管,偶见淋巴结。2、特殊染色：Masson’s三色染色法显示USL中含有大量呈深绿色的胶原纤维,是USL中含量最多的纤维结缔组织,少量呈鲜红色平滑肌纤维,与胶原纤维交错存在；Gomori’s氨银法染色显示胶原纤维呈棕黄色,网状纤维呈棕黑色,数量明显少于胶原纤维；Unna地依红染色可见呈棕红色弹力纤维,其数量也明显少于胶原纤维；Schif双染色法显示动脉的弹力纤维为紫红色,动脉腔的内容物为玫瑰红色；Modified Loyes’染色法见神经纤维(轴索)成黄白色,髓鞘未见着色(阳性呈深蓝色),证实其中的神经组织为无髓鞘的神经纤维。3、免疫组化染色：CD-34抗体染色可见血管内皮细胞呈棕黄色,结合HE染色结果及Schiff双染色法进一步证实USL含有动、静脉血管；S-100蛋白抗体结果显示神经组织呈棕黄色,结合HE染色结果及Modified Loyes’染色法结果再次提示USL中含有神经组织成分,为自主神经；TH抗体(交感神经特异性抗体)和VIP抗体(副交感神经特异性抗体)结果阳性(棕黄色),提示神经成分为交感神经和副交感神经,可见交感神经节,未见副交感神经节；D2-40抗体染色可见USL中含有大量的淋巴管,偶见淋巴结。[结论]一、骶子宫韧带中包含大量血管,以中、小动静脉为主,微静脉和微动脉多见；二、富含自主神经节及神经束,自主神经以交感神经为主,可见交感神经节；仅发现三个标本的切片中有副交感神经视野,每个切片仅一个阳性指标视野,均位于USL的近段组织切片上,所有标本均未见副交感神经节。三、淋巴管含量丰富,可见少许淋巴结或淋巴细胞聚团；四、纤维结缔组织以胶原纤维为主,其次为网状纤维,而弹力纤维和平滑肌纤维量相对较少；五、富含脂肪组织。第二部分：骶子宫韧带中神经与脉管成分的定量分析[目的]探讨骶子宫韧带中血管、淋巴、交感神经及副交感神经的含量及分布规律,根据USL各精细组织成份的分布特点构建出USL中神经、血管及淋巴的分布图,为系统保留盆腔自主神经的广泛性子宫切除术中关于USL切除部分的设计提供直观的病理组织学依据。[方法]为了方便描述和比较,在收集USL标本时标记好上缘(近心侧)、下缘、内侧(近直肠侧)、外侧,捞片时USL切片上缘均与玻片上缘吻合,同时根据标本的标记在切片上标出上缘、下缘、内侧、外侧。按照显微镜上的刻度值,于正中部位,将USL分为上半部、下半部或内侧面、外侧面。将玻片置于显微镜系统进行图片拍摄,每张玻片上、下半部各随机取10个视野,交感神经及淋巴染色玻片的内侧面、外侧面再重新随机各取10个视野。29条USL交感神经、副交感神经、血管和淋巴各有87张玻片,因此,交感神经和淋巴分别采集图像3480张,血管和淋巴各采集图片1740张,共采集图片10440张。采用Impro图像分析软件和生物体视学对其中神经与脉管成分进行定量分析,计算出USL中总体及各部分、各侧面中神经与脉管的体积密度(volume density, Vv),对比三段及各部分、各侧面之间神经与脉管含量。根据定量研究所得的神经脉管成份的分布规律,利用CAD及photoshop软件构建出USL精细解剖的分布图。应用SPSS13.0统计软件进行分析,以P<0.05认为差异具有统计学意义。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,USL近、中及远段各数据比较采用One-Way ANOVA方差分析,满足方差齐性的多重组间比较采用LSD (Least Signifficant Deffence)法,方差不齐多重组间比较采用DunnettT3法,USL上、下两半部或内、外两侧面各指标数据的比较采用Independent-Samples T检验。[结果](一).骶子宫韧带内的交感神经体积密度(Vv)：1、骶韧带近、中、远三段标本细分为上半部、下半部：1)骶子宫韧带交感神经总体Vv为(0.0071±0.0183)；2)上半部(0.0037±0.0100)和下半部(0.0104±0.0235),下半部交感神经Vv显著大于上半部(t=-2.428,P=0.017)。3)近/中/远段交感神经Vv分别为：(0.0047±0.0110)/(0.0041±0.0110)/(0.0123±0.0271)；交感神经含量在三段间存在显著差异(F=3.738,P=0.026),远段的交感神经含量高于近段(P=0.025),也高于中段(P=0.015)。4)近段上半部(0.0031±0.0096)和近段下半部(0.0064±0.0122),交感神经体积密度无明显差异(t=-1.114,P=0.27；中段上半部(0.0012±0.0031)和中段下半部(0.0070±0.0148),下半部交感神经体积密度高于上半部(t=-2.056,P=0.048)；远段上半部(0.0069±0.0136)和远段下半部(0.0178±0.0352),交感神经体积密度无明显差异(t=-1.558,P=0.128)。5)上半部近、中和远三段间交感神经体积密度：(0.0031±0.0096)、(0.0012±0.0031)、(0.0069±0.0136),三者之间无明显差异(F=2501,P=0.088)；下半部近、中和远三段间交感神经体积密度(0.0063±0.0122)、(0.0070±0.0148)、(0.0178±0.0352),三者之间无明显差异(F=2230,P=0.114)。2、骶韧带近、中、远三段标本细分为内侧面、外侧面：1)内侧面(0.0035±0.0098)和外侧面(0.0106±0.0235),外侧面交感神经Vv显著大于内侧面(t=-2.604,P=0.010)；2)近/中/远段交感神经Vv分别为：(0.0041±0.0081)/(0.0104±0.0268)/(0.0066±0.0145)；交感神经含量在三段间无显著性差异(F=1.769,P=0.174)；3)近段内侧面(0.0014±0.0026)和近段外侧面(0.0068±0.0106),外侧面交感神经含量明显大于内侧面(t=-2.677,P=0.001)；中段内侧面(0.0052±0.0115)和中段外侧面(0.0157±0.0357),内侧面与外侧面的交感神经含量无明显统计学差异(t=-1.503,P=0.142)；远段内侧面(0.0039±0.0121)和远段外侧面(0.0093±0.0164),外侧面感神经体积密度高于内侧面(t=-1.441,P=0.048)。4)内侧面近、中和远三段间交感神经体积密度：(0.0014±0.0026)、(0.0052±0.0115)、(0.0039±0.0121),三者之间无明显差异(F=1.129,P=0.328)；外侧面近、中和远三段间交感神经体积密度(0.0068±0.0106)、(0.0157±0.0357)、(0.0093±0.0164),三者之间无明显差异(F=1.093,P=0.340)。(二).骶子宫韧带内的副交感神经：仅3个近段的切片中观察到副交感神经视野,每个视野各含一个副交感神经,其体积密度分别为：0.0012,0.0008,0.0004。(三).骶子宫韧带内血管体积密度(Vv)：1)骶子宫韧带血管总体Vv为(0.0904±0.0781)；2)上半部(0.0854±0.0734)和下半部(0.0954±0.0826),上、下部血管体积密度无明显差异(t=-0.848,P=0.397)。3)近/中/远段血管体积密度分别为：(0.1096±0.0936)/(0.0826±0.0641)/(0.0790±0.0712)；血管含量在三段间无显著差异(F=2.709,P=0.069)；4)近段上半部(0.948±0.0879)和近段下半部(0.1243±0.0983),血管体积密度无明显差异(t=-1.203,P=0.234)；中段上半部(0.0719±0.0470)和中段下半部(0.0933±0.0769),血管体积密度无明显差异(t=-1.276,P=0.208)；远段上半部(0.0894±0.0795)和远段下半部(0.0687±0.0614),血管体积密度无明显差异(t=1.107,P=0.273)。5)上半部近、中和远三段间血管体积密度：(0.0948±0.0879)、(0.0719±0.0470)、(0.0894±0.0795),三者之间无明显差异(F=0.765,P=0.468)；下半部近、中和远三段间血管体积密度：(0.1243±0.0983)、(0.0933±0.0769)、(0.0687±0.0614),三者之间血管体积密度有明显差异(F=3.495,P=0.035)；近段血管体积密度明显大于远段(P=0.010),近段与中段的血管体积密度无显著差异(P=0.145),中段与远段的血管体积密度也无显著差异(P=0.247)。(四).骶子宫韧带内的淋巴管体积密度(Vv)：1、骶韧带近、中、远三段标本细分为上半部、下半部：1)骶子宫韧带中淋巴管的总体体积密度为(0.0087±0.0121)；2)上半部(0.0097±0.1340)和下半部(0.0074±0.0106),上、下部淋巴管体积密度无明显差异(t=1.250,P=0.213)。3)近/中/远段淋巴管体积密度分别为：(0.0130±0.0149)/(0.0068±0.0100)/(0.0058±0.0094)；淋巴管含量在三段间存在显著差异(F=6.419,P=-0.002)；近段大于中段,存在明显差异(P=0.005),近段大于远段,存在明显差异(P=0.001)中段与远段无明显差异(P=0.657)。4)近段上半部(0.0124±0.0163)和近段下半部(0.0137±0..0137),淋巴管体积密度无明显差异(t=-0.322,P=0.748)；中段上半部(0.0095±0.0126)和中段下半部(0.0041±0.0055),淋巴管上半部显著大于下半部(t=2.090,P=0.043)；远段上半部(0.0072±0.0106)和远段下半部(0.0044±0.0081),淋巴管体积密度无明显差异(t=1.136,P=0.261)。5)上半部近、中和远三段间淋巴管体积密度：(0.0123±0.0163)、(0.0094±0.0126)、(0.0072±0.0106),上半部近、中和远三段间淋巴管体积密度无明显差异(F=1.078,P=0.345)；下半部近、中和远三段间淋巴管体积密度：(0.0136±0.0137)、(0.0041±0.0055)、(0.0044±0.0081),下半部近、中和远三段间淋巴管体积密度有明显差异(F=9.029,P=0.0003)。近段大于中段,存在明显差异(P=0.000),近段大于远段,存在明显差异(P=0.000),中段与远段无明显差异(P=0.910)。2、骶韧带近、中、远三段标本细分为内侧面、外侧面：1)内侧面(0.0091±0.0103)和外侧面(0.0026±0.0038),内侧面淋巴结体积密度明显大于外侧面(t=5.559,P=0.000)。2)近/中/远段淋巴管体积密度分别为：(0.0063±0.0079)/(0.0058±0.0083)/(0.0054±0.0090)；淋巴管含量在三段间无显著差异(F=0.188,P=0.829)；3)近段内侧面(0.0095±0.0092)和近段外侧面(0.0031±0.0048),内侧面淋巴管体积密度显著大于外侧而(t=3.329,P=0.002)；内侧面中段(0.0095±0.0103)和外侧面中段(0.0021±0.0025),内侧面淋巴管体积密度明显大于外侧面(t=3.747,P=0.001)；远段内侧面(0.0083±0.0115)和远段外侧面(0.0025±0.0039),内侧面淋巴管体积密度明显大于外侧面(t=2.574,P=0.015)。4)内侧面近、中和远三段间淋巴管体积密度：(0.0095±0.0092)、(0.0095±0.0103)、(0.0083±0.0115),内侧面近、中和远三段间淋巴管体积密度无明显差异(F=0.136,P=0.873)；外侧面近、中和远三段间淋巴管体积密度：(0.0031±0.0048)、(0.0021±0.0025)、(0.0025±0.0039)；淋巴管含量在三段间无显著差异(F=0.559,P=0.574)。(五).根据上述定量结果,构建出USL的精细解剖分布图。[小结]一、自主神经的分布：1.交感神经的分布：(1)将近、中、远三段标本细分为上半部、下半部1)下半部>上半部(P=0.017)；2)中段：下半部>上半部(P=0.048)；3)远段>近段(P=0.025),远段>中段(P=0.015)；(2)将近、中、远三段标本细分为内侧面、外侧面1)外侧面>内侧面(P=-0.010)；2)近段：外侧面>内侧面(P=O.001)；3)中段：外侧面较内侧面有明显增高的趋势；4)远段：外侧面>内侧面(P=O.048)。小结：交感神经主要集中在骶子宫韧带的外侧面,以下半部远段居多。2.副交感神经的分布：仅在骶子宫韧带的近段有极少量分布。二、血管的分布：骶韧带中血管各段比较无明显统计学差异,但由远段向近段有增多的趋势。三、淋巴管的分布：1.将近、中、远三段标本细分为上半部、下半部1)中段：上半部>下半部(P=0.043)；2)总体：近段>中段(P=0.005),近段>远段(P=0.001)；3)下半部：近段>中段(P=0.000),近段>远段(P=0.000)。2.将近、中、远三段标本细分为内侧面、外侧面1)内侧面>外侧面(P=0.000)；2)近段：内侧面>外侧面(P=0.002)；3)中段：内侧面>外侧面(P=0.001)；4)远段：内侧面>外侧面(P=0.015)。小结：淋巴管主要集中在骶子宫韧带的内侧面,近段多于中段及远段。四、结论：根据以上结果,骶子宫韧带中神经、血管及淋巴管的分布各有特点。1、交感神经主要分布于USL的外侧面,下半部远段较多；2、副交感神经含量极少,均位于近段；3、淋巴主要分布于USL的内侧面,近段较多；4、血管由远段向近段有增多的趋势。根据这些分布特点可构建出骶韧带精细解剖的分布图,清晰地重现骶子宫韧带中与手术相关的重要组织的位置关系及分布特点,使得USL的显微结构更直观,为SNSRH术的改良提供病理学依据,也为SNSRH模拟训练手术模型的构建提供了参考。