论文部分内容阅读
目的:探讨胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)是否通过激活蛋白酶体相关核转录因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)上调神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)蛋白酶体活性,进而促进NSCs增殖和分化,旨在寻求维持NSCs自我更新活力的有效靶点,为治疗神经退行性疾病延缓衰老提供新思路。方法:1、分离培养新生(Postnatal day 0,P0)小鼠海马NSCs,IGF-1作用24 h后,分析不同浓度IGF-1对NSCs蛋白酶体活性及其亚单位PSMB1,PSMB2,PSMB5,PSMA3的mRNA表达变化的影响。2、BrdU掺入实验和Tuj1免疫荧光染色检测IGF-1对NSCs增殖分化潜能的影响。3、Nrf2免疫荧光染色检测IGF-1干预NSCs后,蛋白酶体相关核转录因子Nrf2的表达变化。4、设计合成靶向Nrf2的siRNA序列及其对照negative control(NC)序列,电转染NSCs,从mRNA和蛋白水平验证敲除效率。应用IGF-1(100 ng/mL)作用于siRNA组和NC组NSCs,应用荧光酶标仪检测蛋白酶体活性,BrdU和Tuj1免疫荧光染色、SA-β-gal染色以及CCK8实验分析IGF-1是否通过激活Nrf2影响NSCs蛋白酶体活性,进而调控NSCs活力。结果:1、随IGF-1浓度增加NSCs蛋白酶体活性增高,其中50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1组NSCs蛋白酶体活性分别是PBS对照组1.75±0.26(P<0.01)倍和2.02±0.19(P<0.05)倍。IGF-1作用24 h后提取NSCs总RNA,Real-time PCR检测蛋白酶体亚单位的表达变化,20、50、100 ng/m L IGF-1能够使NSCs PSMA3的mRNA表达较PBS对照组升高1.11±0.02倍(P<0.05)、1.16±0.03倍(P<0.01)和1.17±0.03倍(P<0.01)。此外,100 ng/m L IGF-1还能够使NSCs PSMB5的mRNA表达水平增高1.18±0.04倍(P<0.05)。2、BrdU免疫荧光染色结果显示IGF-1作用24 h能够提高NSCs增殖能力,50ng/m L组和100 ng/m L组BrdU阳性率分别是37.83%±2.71%和39.36%±3.28%,显著高于PBS对照组30.08%±2.42%(P<0.05)。Tuj1免疫荧光染色结果也显示,应用50 ng/m L和100 ng/m L IGF-1作用于NSCs 3 d,Tuj1阳性新生神经元数量分别是34.32%±3.04%和47.27%±3.37%,显著高于PBS对照组20.22%±1.92%(P<0.05),提示IGF-1能够促进NSCs向神经元方向分化。3、IGF-1干预NSCs 24 h,Nrf2免疫荧光染色显示IGF-1组细胞核荧光信号增强。MetaMorph分析软件表明随IGF-1浓度增高,Nrf2荧光信号细胞核/细胞质比值(核/质比)逐渐增高,20 ng/mL,50 ng/m L和100 ng/m L组分别是PBS对照组的1.32±0.12倍,1.41±0.11倍和1.52±0.21倍(P<0.05)。结果提示IGF-1能够促进蛋白酶体相关核转录因子Nrf2转录激活。4、NSCs电转染靶向Nrf2的siRNA序列,western blot结果显示siRNA干扰效率为34.28%±7.28%(P<0.01)。应用100 ng/mL IGF-1作用于siRNA组和NC对照组24 h后,siRNA组蛋白酶体活性较NC组降低0.37±0.04(P<0.001)。此外IGF-1干预后siRNA组NSCs增殖能力和Tuj1阳性率也分别较NC组下降6.24%±0.83%(P<0.05)和6.34%±1.05%(P<0.05),细胞活力下降0.83±0.07(P<0.001),衰老细胞阳性率增加12.39%±1.37%(P<0.05)。提示在IGF-1可能通过激活Nrf2上调NSCs蛋白酶体活性,进而提高细胞活力。结论:1、IGF-1可以提高NSCs的蛋白酶体活性,促进NSCs增殖分化,维持细胞自我更新。2、IGF-1可能通过激活Nrf2上调NSCs蛋白酶体活性,进而提高细胞活力。