蒙古羊间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化

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间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞。对许多物种的研究证明这类干细胞在体外可分化为多种细胞表型,是未来细胞、基因治疗、组织工程的理想种子细胞之一。目前尚未见绵羊尤其是蒙古绵羊间充质干细胞的研究报道。本研究旨在建立蒙古羊骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)系,了解其生物学特征,并在体外进行成脂、成骨和软骨诱导分化与鉴定,为今后利用这类间充质干细胞作为疾病细胞、基因治疗的模型,以及将其作为体细胞克隆核供体的研究奠定必要的基础。本文以成年蒙古绵羊为实验对象,采集股骨骨髓和肾脏外围脂肪组织,采用密度梯度离心法和胶原酶消化法获得骨髓和脂肪间充质细胞,系统地研究了其生物学特性以及体外诱导分化能力。主要结果如下:1、分离得到的蒙古羊BMSCs和ADSCs形态均呈现长梭形,易形成细胞集落。二者生长曲线都表现为S形。经计算其细胞倍增时间,BMSCs平均为31h,ADSCs平均为30h。2、对传代10代(P10)、20代(P20)、30代(P30)BMSCs和ADSCs进行染色体核型分析,正常核型率分别P10:90%(49/54)、85%(46/54);P20:87%(47/54)、83.3%(45/54);P30:81%(44/54)、88%(48/54)。表明间充质细胞在体外长期传代培养中,能保持较强的增殖能力和较好的遗传稳定性。3、在成脂诱导培养条件下,蒙古羊BMSCs和ADSCs在诱导两周左右时,细胞由长梭形变为圆形的成熟脂肪细胞形状,内分布大量脂滴。油红O染色呈阳性,RT-PCR可检测到脂肪特异性基因Leptin和PPAR的表达。在组织学和基因水平证实BMSCs和ADSCs可分化成为脂肪细胞。4、经成骨培养基诱导,两周左右细胞内出现矿化骨结节,约三周时,骨结节更明显。茜素红、Von Kossa和碱性磷酸酶(ALP)染色均呈阳性。RT-PCR检测,表达了骨细胞特异基因Osteocalcin及CBFA,证明成功将BMSCs和ADMCs诱导为成骨细胞。5、在三维立体成软骨诱导培养约4周后,BMSCs和ADSCs诱导为软骨颗粒,经甲醛固定、包埋切片,HE和Alcian Blue染色均呈现阳性。RT-PCR鉴定表明,两类细胞均表达了软骨细胞特异基因Aggrecan及Sox9。实验证实我们分离到的两类细胞在体外具有自我更新和多向分化能力,为纯化的BMSCs和ADSC,有望成为细胞治疗、组织工程的种子细胞来源,也可作为体细胞克隆的供体细胞,为临床医学应用及家畜基因改良奠定了前期研究基础。
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