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目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS),是一种发病率较高的睡眠呼吸障碍性疾病,同时也是神经系统认知功能障碍发生发展的重要危险因素。间歇低氧(IH)作为OSAHS主要的病理生理学特征,其反复发生的低氧/复氧过程可以诱导海马神经细胞损伤。认知功能障碍作为老年OSAHS患者常见并发症,其发生机制可能与间歇低氧所致海马神经细胞损伤有关。自噬是维持细胞稳态的重要生理机制,近年来有研究发现自噬在缺血/缺氧所致系统性损伤中发挥重要作用。然而在间歇低氧条件下,自噬激活的具体机制以及自噬对神经系统损伤的影响目前尚未清楚阐明。因此,本研究通过模拟人OSAHS建立间歇低氧模型,从体外实验角度观察间歇低氧损伤后海马神经细胞自噬的表达,并进一步通过药物干预检测间歇低氧所致海马神经细胞自噬流量的变化,拟探讨自噬的激活在间歇低氧所致海马神经细胞损伤中的作用。方法:取新生SD乳鼠(24小时内)海马组织进行原代神经细胞培养,至第7天,采用免疫荧光对海马神经元进行鉴定。①建立不同时间段的间歇低氧细胞模型,设正常对照组(NC)、间歇低氧组(IH)4h、间歇低氧组8h和间歇低氧组12h。间歇低氧组分别循环给予氧浓度为1.5%的低氧5min和21%的常氧10min处理4h、8h和12h,正常对照组持续给予氧浓度为21%的常氧。采用免疫荧光和免疫印迹检测间歇低氧不同时间段内自噬特异性微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin1和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)蛋白的表达,TUNEL法检测不同时间段内海马神经细胞凋亡的变化。②给予自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹预处理后再建立间歇低氧细胞模型,设正常对照组、间歇低氧组(12h)、药物预处理组、单独给药组和饥饿组。间歇低氧组于间歇低氧舱内处理12h;药物预处理组分别给予雷帕霉素和氯喹稀释液预处理12h后,再置于间歇低氧舱内暴露12h;单独给药组分别给予雷帕霉素和氯喹处理12h;饥饿组即间歇低氧阳性对照组给予EBSS无糖培养液培养12h。采用免疫印迹检测各实验组自噬相关蛋白LC3-I向LC3-II的转化,即LC3-II/LC3-I和P62蛋白的表达。③实验模型的建立及实验分组同步骤②。采用免疫印迹检测各实验组自噬相关蛋白LC3-II和cleaved caspase-3的表达,免疫荧光检测各实验组LC3蛋白表达,TUNEL检测各实验组海马神经细胞凋亡的变化。结果:①间歇低氧对新生鼠原代海马神经细胞自噬相关蛋白表达的影响:间歇低氧组自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达明显增多,且随着间歇低氧时间的延长LC3和Beclin1表达也逐渐增多。间歇低氧12h表达最多,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(**P<0.05)。②间歇低氧对新生鼠原代海马神经细胞自噬流量的影响:与正常对照组相比,间歇低氧组LC3-II/LC3-I表达显著增多,而P62蛋白表达则明显降低,差异均具有统计学意义(**P<0.05);与雷帕霉素单独给药组相比,雷帕霉素+间歇低氧组LC3-II/LC3-I表达显著增高,而P62蛋白表达则明显降低,差异均具有统计学意义(**P<0.05);与氯喹单独给药组相比,氯喹+间歇低氧组LC3-II/LC3-I表达显著增高,P62蛋白表达则明显降低,差异均具有统计学意义(***P<0.05);与正常对照组和DMSO组相比,雷帕霉素单独给药组LC3-II/LC3-I表达显著增高,差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.05),而DMSO组与正常对照组相比LC3-II/LC3-I表达无显著差异;与正常组相比,EBSS组LC3-II/LC3-I表达显著增高,而P62蛋白表达则显著降低,差异具有统计学意义(*P<0.05),但与间歇低氧组相比,LC3-II/LC3-I和P62表达均无明显差异。③干预自噬流量对间歇低氧所致海马神经细胞凋亡的影响:间歇低氧组凋亡阳性细胞数和cleaved caspase-3表达明显增高,且随着IH时间的延长,二者表达也逐渐增多。间歇低氧12h表达最多,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(**P<0.05);雷帕霉素+间歇低氧组cleaved caspase-3表达和凋亡阳性细胞表达显著高于间歇低氧组。而氯喹+间歇低氧组cleaved caspase-3表达和凋亡阳性细胞数目较间歇低氧组明显减少,差异均具有统计学意义(**P<0.05,***P<0.05);雷帕霉素单独给药组cleaved caspase-3蛋白表达和凋亡阳性细胞数目显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(*P<0.05),但DMSO组与正常对照组相比cleaved caspase-3表达无显著差异。结论:本研究证实:1.间歇低氧诱导海马神经细胞自噬的表达增多。2.间歇低氧诱导海马神经细胞自噬的激活。3.自噬的激活加重了间歇低氧所致海马神经细胞的损伤。