精原细胞是雄性成体体内唯一能将遗传信息完整传递给后代的二倍体细胞。随着科学技术的发展,干细胞研究领域逐渐形成一个干细胞与再生医学想结合的研究领域,其目的是将干细胞潜能应用到实践中,为医学的相关研究提供一个研究方向和平台。但是精原干细胞冷冻保存效率低下严重限制了相关研究的进行,鉴于此,很多研究者开始从不同角度出发去寻求一个高效的冷冻保存方案。本研究立足新型生物材料的引入,在体外环境下构建一个微环境,直接对微环境下的细胞进行冷冻保存操作,以期能提高细胞尤其是精原干细胞的冷冻保存效率。1.海藻酸微囊的制作方法海藻酸微囊是利用海藻酸盐溶液遇到多种二价阳离子能交联生成凝胶这一特性生成的。生成海藻酸微囊的方法包括高压静电微囊发生装置制作法、毛细管破碎制作法、气体吹喷制作法等,本文综合各个方法的优点和缺点。鉴于高压静电微囊发生装置制作法具有操作方便、效率高、生成微囊大小均匀等优点,本研究采用高压静电微囊发生装置制作海藻酸微囊。生成了大小均一,形态完整,直径在300μm左右的海藻酸-Ca2+微囊,所得微囊能用于细胞的包埋和进一步的相关研究。2.海藻酸微囊替代DMSO和FBS的STO细胞冷冻保存研究目的：改进现有的细胞冷冻保存方法,建立一个不含二甲基亚砜(DMSO)和血清(FBS)的高效冷冻保存方法,为细胞治疗等临床实践提供优质细胞。方法：设五个实验组：藻酸微囊包埋STO细胞不含DMSO和FBS的冷冻保存(微囊D-F-)、添加10%DMSO和20%FBS的组(D+F+)、仅添加10%DMSO的组(D+F-)、仅添加20%FBS (D-F+)、DMSO和FBS均不添加组(D-F-)。在冷冻前后对各实验组细胞用台盼兰染色,进行细胞计数,计算细胞存活率,同时利用溴乙锭的二聚物(EthD)、钙黄绿素-AM (Calcein-AM)进行染色观察细胞的形态,且进一步验证细胞存活率；解冻复苏后用MTT法评估细胞的增殖速度和生长活力。结果：冷冻保存30d后对各组的细胞数量、细胞存活率、细胞形态和解冻复苏后细胞的生长活力进行比较发现,海藻酸微囊包埋冷冻组的细胞数、细胞存活率、细胞形态和生长活力均与添加DMSO和FBS的组之间无显著性差异,而与其它三个对照组呈显著性差异。结论：使用海藻酸微囊替代DMSO和FBS保存STO细胞,能有效的维持细胞形态、数量、存活率,同时不影响细胞的生长活力,从而建立了一个不含DMSO和FBS的高效冷冻保存方法。3.用海藻酸微囊法冷冻保存绵羊精原干细胞细胞冷冻保存技术是动物研究的重要组成部分。本研究首次应用海藻酸微囊冷冻保存绵羊精原干细胞(SSCs),旨在提高绵羊SSCs的冷冻保存效率。在绵羊SSCs液氮冻存1d后对绵羊SSCs进行存活率评估、细胞生长增值能力比较和CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1五个精原干细胞特异分子标记基因的免疫荧光鉴定。结果表明,在液氮冻存1d后,单细胞悬液冻存组绵羊SSCs活率为58.4%士1.4%,海藻酸微囊包埋冻存组为78.7%士1.3%,同时海藻酸微囊包埋冻存组细胞恢复生长增值能力明显好于单细胞悬液冻存组,解冻培养四d,海藻酸微囊组细胞数为2.1×105cells/孔,显著高于单细胞悬液冻存组(1.1×105cells/孔)。解冻复苏培养后进行细胞免疫荧光鉴定,发现在微囊包埋冻存1d后CDH1、PLZF、GFRα1、OCT-4、Thy-1均显示阳性。在液氮冻存10d后,海藻酸微囊组绵羊SSCs存活率仍然维持在78.0%士1.5%,与液氮冻存1d时细胞存活率(78.7%士1.3%)和冻存前细胞存活率(82.2%士1.9%)相比没有显著下降,而在单细胞悬液冻存组中,细胞存活率从82.2%士1.9%一直下降到液氮冻存1d的58.4%士1.4%和液氮冻存10d的48.1%士0.8%。也就是说海藻酸微囊包埋绵羊SSCs细胞进行冷冻保存,细胞的存活率不会随着液氮冻存时间的增加而显著下降,同时冻存10d后绵羊SSCs仍然保持着快速恢复生长增值能力,表达绵羊SSCs的特异标记基因。综上所述,海藻酸微囊的应用显著提高了绵羊SSCs的冷冻保存效率,且对绵羊SSCs的标记基因表达无显著影响。本方法的建立为其他家畜及濒危动物种质资源保存提供了参考。