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目的:变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)主要引起人类龋齿的发生。除了可引起龋齿之外,还可引起牙髓病和牙周病等一系列疾病,严重影响人们的健康和生活质量。S.mutans中存在Clp蛋白酶,其可通过解折叠或降解,对外界应激环境刺激产生的异常蛋白质进行消除。Clp蛋白酶复合物包括含有丝氨酸蛋白酶活性位点的Clp P蛋白催化亚基和高度保守的Clp ATP酶调节亚基。Clp X是可与Clp P蛋白特异性结合形成Clp XP蛋白酶复合物的Clp ATP酶之一。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)等中,Clp XP蛋白酶复合物发挥着重要的水解蛋白的作用,其水解过程是通过Clp ATPase对蛋白底物所带的tag的特异识别来完成的,从而通过对异常蛋白的降解来调控细菌的生物学性状,应激耐受和生物膜形成。S.mutans与枯草芽孢杆菌都是低GC含量的革兰阳性球菌,且Clp水解蛋白酶具有较高的同源性。经比对,S.mutans有Clp P和5种Clp ATP酶,分别是Clp X、Clp B、Clp C、Clp E和Clp L。故本研究拟构建S.mutans UA159的clp X/clp P基因突变株,通过观察细菌形态、制作生长曲线、平板生存耐受试验、生物膜形成试验等初步探讨Clp X和Clp P蛋白酶复合物在变异链球菌应激耐受和生物膜形成的作用机制,并在体内外诱导Clp X和Clp P蛋白酶表达,初步了解Clp XP蛋白酶复合物识别底物的作用机制。方法:(1)以S.mutans UA159为模版,PCR扩增clpX基因片段,插入pMD-20T载体,连入经PCR扩增的lox71-kan-lox66片段,构建clp X突变同源重组载体p CKS3。(2)借助感受刺激多肽(competence-stimulating peptide,CSP),将线性化的p CKS3转化S.mutans UA159和S(35)clp P,获得(35)clp X::kan和(35)clp XP::kan株,同法转化热度敏感质粒p Cre PA,30℃培养删除抗性基因,再转37℃培养删除p Cre PA,获得S(35)clp X和S(35)clp XP突变株。(3)以pEGFP-N1为模版,PCR扩增gfp基因片段,连入带启动子的pDLP,获得蛋白酶体内荧光表达载体p CKS6及其菌株SCKS6。荧光显微镜下观察菌株SCKS6的荧光表达情况。(4)PCR扩增clp X基因开放阅读框片段(ORF),连入带启动子的p DLP,转化突变株S(35)cp X,得到补偿株Sclp X。(5)记录细菌一定生长时间的OD600值,以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,观察构建的菌株与野生株的生长状况。(6)配制p H 5.0、6.0、8.0和1%Na Cl、2.0%Na Cl和2.5%Na Cl的THY琼脂培养基进行生长耐受试验,比较各菌株的生存能力。(7)将各菌株分别培养于0.5%葡萄糖和0.5%蔗糖的THY培养基中48 h,蒸馏水洗涤后采用结晶紫染色并用显微镜观察生物膜形成情况;以乙醇和丙酮洗涤液进行洗脱附着染料并检测其OD570值。(8)将各菌株于0.5%葡萄糖和0.5%蔗糖的THY培养基中培养48 h的生物膜经固定、干燥、脱水、封固和喷金处理,电镜观察生物膜胞外多糖成分(Exopolysaccharides,EPS)形成情况。(9)将各菌株于0.5%蔗糖的THY培养基中培养48 h生物膜,分别于24 h加入Dextran,Alexa Fluor?647和48 h加入SYTO?9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain处理,激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜及EPS形成情况。(10)PCR扩增clp P、clp X基因开放阅读框,分别连入p ET-21(b)和p GEX-4T-1表达载体,构建重组表达载体p CKS1和p CKS5,转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),获得表达菌株SCKS1和SCKS5。(11)用IPTG诱导菌株SCKS1和SCKS5表达目的蛋白Clp P和Clp X,超声破碎细胞提取细菌总蛋白,以Ni-NTA SefinoseTM和Glutathione Sefinose蛋白纯化试剂盒分别对Clp P和Clp X纯化,得到纯化后的目的蛋白Clp P和Clp X。(12)用SDS-PAGE进行蛋白电泳,考马斯亮蓝染胶,脱色后观察目的蛋白Clp P和Clp X的表达情况。结果:(1)经PCR、酶切及DNA测序验证,成功构建同源重组载体p CKS3和S.mutans UA159突变株S(35)clp X和S(35)clp XP。(2)成功构建体内荧光表达载体pCKS6及其菌株SCKS6,荧光显微镜下观察到菌株SCKS6发出绿色荧光。(3)经PCR、酶切及DNA测序验证,成功构建补偿质粒p CKS4和补偿株Sclp X。(4)野生株S.mutans UA159成链较短;突变株S(35)clp X呈长链聚集生长,且菌体较粗短,与突变株S(35)clp P相似(5)37℃5%CO2培养,与野生株S.mutans UA159相比较,突变株S(35)clp P、S(35)clp XP、S(35)clp X生长缓慢,突变株和补偿株Sclp X相比无明显差别。(6)平板生存试验观察,S(35)clp P的酸耐受和盐耐受能力呈明显下降趋势,碱耐受能力下降;S(35)clp X的酸耐受和碱耐受能力与野生株相比无明显变化,盐耐受能力在Na Cl>1%时降低。p H 8.0时,菌落均较大而湿润,p H<7时,菌落较小。(7)变异链球菌在含Sucrose培养基中生成生物膜能力明显强于Glucose培养基;在0.5%Glucose THY培养基中clp P和clp X突变株生成生物膜能力明显降低;0.5%Sucrose THY培养基中clp P和clp X突变株生成生物膜能力反而增强;补偿株Sclp X生成生物膜能力基本与野生株水平相当。(8)变异链球菌在0.5%Sucrose的THY培养基中生成的EPS比在0.5%Glucose的THY培养基中生成的EPS明显增多;在Glucose存在下,突变株和野生株生成EPS的量无明显变化;Sucrose存在下,clp X和clp P基因突变株S(35)clp X和S(35)clp P的EPS生成量相比野生株明显增多,且S(35)clp P生成的大量EPS呈片状,而clp P基因补偿株Sclp P的EPS生成量则几乎恢复到野生株水平。(9)成功构建p CKS1和p CKS5重组表达载体及相应表达菌株SCKS1和SCKS5,成功诱导表达并纯化目的蛋白Clp P和Clp X。结论:ClpXP蛋白水解酶复合物在维持变异链球菌内部环境稳定状态及调控毒力方面发挥重要作用,参与调节细菌形态、生物膜生成、抵抗外界应激条件等。体外蛋白的诱导与纯化和体内荧光表达株的构建,为后续了解Clp XP蛋白酶复合物识别底物作用机制和验证其调节毒力机制奠定基础。