论文部分内容阅读
本研究采用混合酸酐法制备了玉米赤霉醇（Zeranol,ZER）免疫原，免疫BALB／c小鼠，用间接酶联免疫吸附法（ELISA）对抗体效价进行了检测，并建立了ELISA检测方法。ZER免疫原（ZER-7-半琥珀酸酯-BSA，以下简称Z7BSA）中半抗原与载体蛋白的偶联比为10∶1，包被原（ZER-7-半琥珀酸酯-OVA，以下简称Z70VA）中半抗原与载体蛋白的偶联比为8∶1。抗血清效价为1∶8000。利用杂交瘤技术获得了两株稳定分泌ZER单克隆抗体（以下简称单抗）的杂交瘤细胞株IC12和9B4。经鉴定两株单抗亚型均为IgG1，杂交瘤细胞染色体数目为95～102条，间接ELISA测定腹水效价为1∶3.2×105，单抗分子量为151.8KD。该单抗与ZER同系物β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮的交叉反应率分别为35.5％，47.4％，7.1％，73.0％，56.3％；与己烯雌酚、雌二醇、睾酮、克伦特罗的交叉反应率均小于0.1％。该细胞株体外传代和冻存复苏后抗体分泌稳定。 用方阵滴定法确定包被原最适工作浓度为0.5μg／ml，单抗最适稀释倍数为1∶5000，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（以下简称酶标二抗）最适稀释倍数为1∶5000。采用间接竞争ELISA方法建立检测ZER的标准曲线，在0.5ng／ml～100ng／ml范围内呈线性相关，回归方程为y=-66.844x+424.15，相关系数R2=0.996，50％抑制浓度(IC50)为3.0ng／ml，以10％抑制率对应的浓度计算，则该方法对ZER的检测限为0.6ng／ml。 以该单抗为基础，进行牛尿中玉米赤霉醇酶联免疫检测试剂盒的研制。确定了试剂盒中各种溶液的配方。试剂盒最低检测限为0.60ng／ml，试剂盒对空白牛尿的最低检测限为7.74ng／ml。以10ng／ml，21ng／ml，35ng／ml 3个浓度添加空白牛尿，回收率在70.0％～116.0％之间，板内变异系数在6.0％～15.9％之间，批内变异系数为15.3％，批间变异系数为14.3％，均低于20％。试剂盒于2～8℃下可保存6个月。