酶是生命活动中一类重要的物质,人体中有5000多种酶参与者各类生物化学反应。酶活性的异常往往与疾病的发生息息相关。研究发现,弗林蛋白酶活性的异常与神经退行性及疾病,如阿尔茨海默病、帕金森症等联系相关;细胞表面具有蛋白激酶活性的人表皮生长因子erb2(HER2)的异常指示着许多癌症的发生,特别是乳腺癌的发生。因此,检测细胞内相关酶的含量及活性对于了解相关病理生理过程就有着非常重要的意义。本论文主要采用了电化学传感和表面增强拉曼光谱两种分析方法,设计并开发了高选择性、高灵敏度、抗干扰的酶传感器用于细胞内酶含量(活性)的分析检测。具体内容如下:(一)设计并开发了一种高灵敏、高选择性、抗干扰的比率型电化学传感器,用于细胞内弗林蛋白酶活性的检测。1)依据Furin可选择性切割含Arg-X-Lys/Arg-Arg↓-X序列的多肽的原理,设计了一种包含此序列的多信号源多肽(P3);2)制备了具有高导电性的,富含多枝结构的金铃铛花纳米材料,显著提高了电极的比表面积,进一步实现识别信号的放大;3)引入内参比分子甲基蓝(MB)共组装于电极界面,构筑比率型电化学传感。结果表明,该传感器对于弗林蛋白酶有良好的电化学响应和较宽的线性范围(1 U/L~50 U/L)。信号放大策略的引入使得传感器的灵敏度提升了6倍。传感界面不仅对常见金属离子、氨基酸、酶、生物分子等具有抗干扰能力,在细胞裂解液中也可有效实现抗生物大分子的污染,而且双信号输出的比率型方法在连续测定两小时内都可以保证比值不变,保证了结果的准确性。这种双信号输出的模式,可有效避免实际测定体系的干扰,显著提高酶测定结果的准确性。最终,利用这一新型传感器,我们成功实现了U251细胞与MDA-MB-468细胞中Furin活性的分析。(二)开发了一种集细胞捕获—原位检测为一体的传感检测平台用于癌细胞的可控捕获及细胞内蛋白HER2含量的检测。1)合成了TMTMS分子与Fc-ATP分子并筛选了RGD多肽和HER2响应的H2多肽。利用TMTMS分子在电化学活化后可以与RGD多肽反应成环,粘附癌细胞;将另一条多肽H2通过EDC/NHS修饰到RGD多肽上,由于H2多肽中的酪氨酸在HER2作用下会发生磷酸化,使得Fc-ATP插入H2中,利用二茂铁的信号便可以反应HER2的含量。2)合成具有无序介孔结构的金膜材料,该材料由于其结构的特殊性,呈现出较高的拉曼增强效果(EF值=1.15×10~5)和优异的抗污染能力。实验发现,利用上述材料和分子构筑的Fc-H2+RGD/TMTMS/MesoGF/Au/ITO界面可以实现高选择性高效的细胞捕获,单位面积内,粘附的Hela细胞数约为380个,且细胞保持良好的形态和较高的生物活性,此外,该界面在-0.2V下可以实现细胞的释放,界面更新和循环使用。通过优化Fc-ATP探针的浓度为200μg/mL,实现了5~100ng/mL HER2的拉曼检测。该传感界面对于细胞中的阴离子、阳离子、氨基酸和与HER2作用相似的其他酶或蛋白都有良好的选择性。最终,基于上述分析性能,成功实现了Hela细胞和SK-BR-3细胞的捕获以及其中细胞中HER2含量的原位拉曼检测和拉曼成像,并且利用该界面评估了曲妥顿珠单抗(赫赛汀)药物对于乳腺癌细胞SK-BR-3的抑制和治疗效果。