本文对miRNA-Dextran纳米系统抑制骨肉瘤细胞增殖的研究及Brachyury对脊索瘤临床预后的预测价值进行了研究。本研究分为两个部分：　　第一部分：miRNA-Dextran纳米系统抑制骨肉瘤细胞增殖的研究。骨肉瘤（Osteosarcoma）是最常见的骨骼恶性肿瘤，多于儿童和青少年发病。骨肉瘤进展快，侵袭性强，可经血液转移，预后较差，行新辅助化疗保肢术后5年存活率70％左右。目前，以手术为主全身性化疗为辅的综合治疗是骨肉瘤的主要治疗手段，但这种治疗无法将癌细胞完全清除，骨肉瘤细胞的复发和转移不能真正被控制，给患者造成了沉重的身心痛苦与经济负担。在全身化疗中，药物抵抗、计量限制性毒性严重限制了化疗药物的应用。因此，临床希望有更有效的治疗策略来改善骨肉瘤的治疗。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在肿瘤诊断和治疗中的作用越来越受到关注。miRNA是一组非编码小RNA，与肿瘤的形成、进展、转移、凋亡和药物抵抗均有关。成熟的miRNA结合于靶基因的3’非翻译区（3’UTR），其作用是抑制基因的表达和信使RNA(messenger RNA,mRNA)的转录。有大量研究报道miRNA与肿瘤密切相关，包括骨肉瘤。课题组前期利用miRNA芯片和聚类分析发现在骨肉瘤中异常表达的几种miRNA，其中miR-199a-3p的表达在骨肉瘤细胞系中降低最明显。将miR-199a-3p转染至骨肉瘤细胞内可以显著抑制骨肉瘤细胞的生长和增殖。另一个抑瘤性miRNA，let-7a，被发现在多种肿瘤中的表达下降。相应的，重建let-7a表达可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。因此，转染外源性miRNA进入肿瘤细胞，可抑制肿瘤细胞的增殖，为多种肿瘤的有效治疗提供了可能。虽然，以miRNA为基础的抗肿瘤策略已经成为非常有前景的治疗策略，但是传递miRNA进入细胞依然存在很多问题，限制了这一治疗策略的发展，例如：miRNA在细胞中是高度不稳定的，核酸酶和有限的循环半衰期导致的核酸快速降解、分子量小导致血管内清除速度过快、不能靶向到达肿瘤细胞等，故必须借助有效的运载载体。已有研究证明病毒载体可以有效的运载miRNA进入细胞，但是临床试验发现病毒载体具有更多的副作用，临床治疗更需要非病毒的可靠安全的运载系统。基于此，以多聚纳米粒子为基础的运载系统被发现可用于肿瘤的靶向治疗,其优势包括高转染效率、靶向传递、易修饰、无毒、安全等。在课题组的前期研究中，我们运用Dextran作为起始物制作纳米粒子获得成功。因为Dextran的基础聚合物是以葡聚糖为基础的无毒物，葡聚糖已经在临床上用作血浆扩充剂使用多年，并且通过了国家食品和药品监督管理局的认可。我们也证明了Dextran可以被脂链修饰，以形成亲水纳米粒子，易通过细胞膜。同时，我们证明了以 Dextran为基础的纳米粒子可以传递药物和多药耐药基因MDR1的siRNA进入不同的肿瘤细胞以克服药物耐药。上述研究提示以Dextran为载体的转运系统具有高效转运和无毒的特性，可以被用于运载其它药物或生物分子。但是，Dextran纳米是否可以直接携带 miRNA进入肿瘤细胞，并不影响其功能的发挥，还未见报道。　　目的：验证以Dextran为基础的纳米运载系统，可以携带miRNA（miR-199a-3p、let-7a）形成miRNA-Dextran纳米系统，抑制骨肉瘤细胞的增殖，为 miRNA-Dextran纳米系统用于骨肉瘤的靶向治疗提供实验依据，为骨肉瘤的治疗提供新的思路。　　方法：⑴miRNA-Dextran纳米的合成：由美国东北大学合成的纳米材料，包括：5mg/mL(~2.5 mM)右旋糖酐硫醇衍生物（dextran thiol）,5 mg/mL(~2.5 mM)右旋糖酐乙胺衍生物（dextran hexylamine）和5mg/mL(125μM)硫醇化聚乙二醇（PEG-thiol）。将溶解于无RNA酶纯水中的纳米材料和miRNA溶液按顺序混合，充分溶解后真空抽干制成固体。测量Dextran纳米粒子的粒径和zeta电位。利用1000 Ultra高电压透射电子显微镜获取纳米粒子的透射电子图谱。⑵为寻找转染效率最高的miRNA-Dextran纳米，将纳米材料 dextran hexylamine和dextran thiol按照不同质量比例配置5种不同的纳米粒子，采用Taqman探针法设计引物，结合real-time PCR法检测5种不同纳米粒子携带let-7a转染骨肉瘤细胞U-2OS后，细胞内let-7a mRNA的表达量。以携带入细胞let-7a量最多的纳米粒子为最佳纳米，用于后续实验。⑶应用荧光标记的miRNA-Dextran纳米系统转染骨肉瘤细胞 KHOS、U-2OS，采用荧光倒置显微镜观察转染后2h、4h、24h时miRNA的内摄取情况，并在卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3TR细胞中进行验证。⑷miRNA-Dextran系统转染细胞48h后，提取细胞内RNA，采用Taqman探针法进行Real-time PCR，检测 Dextran纳米携带miRNA进入细胞后，细胞内miRNA的表达量。⑸采用Western blot法检测miRNA-Dextran纳米系统转染细胞后，细胞内miRNA靶基因所表达的蛋白的量的变化，以及不同转染时间和转染浓度对其蛋白表达的影响。⑹采用MTT法检测Dextran纳米系统携带miRNA进入骨肉瘤细胞后，细胞增殖能力的变化。　　结果：①Dextran纳米的平均粒径为351.6±2.5nm。装载miRNA的Dextran纳米带负电荷，其zeta电位为-25.3±7.47mV。②当Dextran hexyl amine为5mg，Dextran thiol为5mg的配比时(命名为Nanoparticle2，NP2)，NP2纳米可携带更多的let-7a进入细胞。5种不同的纳米粒子 NP1、NP2、NP3、NP4、NP5携带 let-7a的量均显著低于商用试剂Lipofectamine RNAi MAX携带的let-7a的量，5种纳米粒子分别与Lipofectamine RNAi MAX比较，P值均小于0.05。NP2与NP3比较没有显著差异性（P>0.05），但远高于NP1、NP4和NP5携带入的let-7a的量（P<0.05）。③携带绿色荧光的AF488-miR-199a-3p和携带红色荧光的A546-let-7a分别与Dextran纳米结合，形成带荧光的miRNA-Dextran纳米。结果发现miRNA-Dextran纳米与骨肉瘤细胞（U-2OS细胞和KHOS细胞）共同孵育2h后，即在细胞内发现荧光信号，并且荧光信号随着孵育时间的延长而增强。同时，经过核染色实验显示Dextran纳米可将miRNA带入细胞浆，而不是细胞核。同时利用卵巢癌细胞系SKOV3和SKOV3-TR做对比，得到同样的结果。④使用携带miR-199a-3p或 let-7a的Dextran纳米分别转染 U-2OS细胞48h后，发现Dextran纳米均可将上述两种miRNA带入U-2OS细胞，使细胞内这两种miRNA的表达量明显上升，miR-199a-3p-Dextran携带miR-199a-3p的量略低于Lipofectamine? RNAiMAX携带的量，差异无统计学意义；但是let-7a-Dextran转载的let-7a的量显著低于使用商业试剂Lipofactmine? RNAimax携带的let-7a的量，P<0.05。⑤在U-2OS和KHOS细胞内，使用miR-199a-3p-Dextran纳米同样可以抑制Met和mTOR蛋白的表达，抑制效果略低于使用Lipofectamine? RNAiMAX转染。在抑制 Met蛋白表达方面，miR-199a-3p的效果略低于使用Met的siRNA转染。IGF-1R为let-7a的靶蛋白，在U-2OS和KHOS细胞内，使用let-7a-Dextran纳米同样可以抑制 IGF-1R蛋白的表达，抑制效果略低于使用Lipofectamine? RNAiMAX转染。随着转染时间的延长，靶蛋白Met和mTOR的表达量越来越高，即miR-199a-3p抑制靶蛋白的功能越来越弱。采用不同转染浓度转染细胞后，发现随着 miR-199a-3p-Dextran纳米浓度越高，Met和mTOR的表达越弱，即miR-199a-3p抑制靶蛋白的功能越强。⑥MTT结果显示：装载miRNA的Dextran纳米转染细胞后，可有效降低KHOS和U-2OS细胞的增殖。在转染72h后，细胞增殖出现明显差异。且在所有细胞和两个不同miRNA中，100nM的miRNA-Dextran对细胞增殖的抑制作用均强于50nM的miRNA-Dextran。　　结论：miRNA-Dextran纳米系统可以有效的将miR-199a-3p和let-7a带入骨肉瘤细胞，起到抑制骨肉瘤细胞增殖的作用。　　第二部分：Brachyury对脊索瘤临床预后的预测价值。脊索瘤是一种罕见的局部恶性侵袭的骨肿瘤，约占到所有骨性恶性肿瘤的1％-4％。脊索瘤总体预后较差，术后局部复发率高，患者多死于局部肿瘤病灶的反复复发。因此亟须寻找到特异的分子标记物为脊索瘤的预后判断提供有利的信息。Brachyury是T-box基因家族的表达产物，是一种重要的转录因子。目前已发现Brachyury在80％的脊索瘤中都会有表达，近年来被认为是诊断脊索瘤的特异性标记物，但是它与脊索瘤临床预后的相关性还未被论述。组织芯片可以一次性检测大量组织样本并消除不同批次实验带来的误差，具有高通量、准确的特点，是研究不同组织中各种生物标记物的良好工具。　　目的：利用脊索瘤的组织芯片对Brachyury在不同疾病状态的脊索瘤患者的表达进行分析，探讨Brachyury作为提示脊索瘤临床预后分子标志物的可能性。　　方法：征集美国麻省总医院骨科1941年至2010年期间，78例脊索瘤组织、7例脊索瘤癌旁正常组织和6例胚胎脊索的存档组织蜡块用于制作组织芯片。所有病理结果在制作前均经过2名病理医生的再次确认。78位患者的中位数年龄为59岁（31-87岁）。采用R&D Systems公司（美国）细胞和组织染色试剂盒，依照试剂盒说明进行免疫组化染色。染色后的组织芯片经2名病理医生采用双盲法读片，对于不一致的读片结果，再次判读，直至取得一致结果，记录在案。在良好的组织结构和清晰的背景下，以细胞核内显现棕色为阳性结果。结果判读采用阳性细胞计数法：0分，没有核内阳性结果；1分，<30％细胞核内染色阳性；2分，31％－60％细胞核内染色阳性；3分，>30％细胞核内染色阳性。所有结果采用Graphpad PRISM统计软件进行分析。各组间 Brachyury的表达差异采用独立样本秩和检验，Brachyury与临床进展及生存时间的关系采用Kaplan-Meier生存分析。　　结果：⑴Brachyury蛋白阳性着色定位于细胞核内，其染色呈淡黄、棕黄或棕褐色，其在脊索瘤组织中的阳性表达率为75.64％（59/78）。Brachyury在胚胎脊索组织中表达全部阳性。根据脊索瘤发生的位置，将脊索瘤分为活动脊柱组和骶尾骨组，发现两组将Brachyury的表达有显著性差异（P=0.027）。骶尾骨的阳性率85.71%(36/42)要高于活动脊柱阳性率57.14%(12/21)。但是不同年龄和不同性别间，Brachyury的表达没有明显差异（P>0.05）。⑵Brachyury在原发性脊索瘤的阳性率为23/29（79.31%），复发性脊索瘤的阳性率为31/41（75..60%），远处转移脊索瘤为5/8（62.5%）。原发性脊索瘤分别与复发性脊索瘤和远处转移脊索瘤相比较，均未见明显差异。⑶78例脊索瘤患者中有61例（78.20%）可追踪到预后结局。其中位数生存时间为68.70个月（3.63-249.63月）。到追踪结束，有27个病例因为此病死亡（DOD），有7例病例带瘤生存（AWD），有23个病例无瘤存活（NED），4个病例因其他疾病死亡。Brachyury在无瘤生存、带瘤生存和因脊索瘤死亡患者中的表达率分别为74.07%（20/27），100%（7/7）和69.56%（16/23），但三组间两两比较无相关性。Kaplan-Meier分析发现Brachyury的表达与脊索瘤患者的生存时间无相关性（P=0.8479）。　　结论：Brachyury在脊索瘤中高表达，但并不能做为预测脊索瘤临床预后的特异性分子标志物。