2000年Gronthos等首次发现具有克隆形成能力和多向分化能力的牙髓干细胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)以来，DPSCs逐渐成为干细胞领域的一个研究热点。然而，牙髓干细胞的异质性以及缺乏特异性表面标记已成为DPSCs研究的瓶颈。1996年，Goodell等在用Hoechst33342染色法研究全骨髓时，发现有极少一部分细胞可以将进入细胞核的荧光染料排出胞外，在荧光显微镜下观察或流式细胞检测时表现为不着色，他们将这类细胞命名为侧群细胞(Side population，SP)。通过具有355nm紫外激发装置的流式细胞仪就可以将这部分细胞检测或分选出来。SP表型是由ABC转运蛋白家族(ATP-binding cassette transporter superfamily)介导的，其中一个主要的介导分子为ABCG2(ATP-binding cassette，sub-family G，member2)或BCRP(Breast cancer resistance protein)。目前SP分选技术已被大量运用于肿瘤干细胞的分离。研究发现SP细胞还存在于多种生物的正常组织，如脐血、骨骼肌、骨、肺、肝、胰腺、表皮细胞、前脑、睾丸、心脏、肾脏、角膜上皮缘、前列腺、唾液腺、乳腺等。这些SP细胞大多具有干细胞特性如自我更新和多向分化能力。还有研究表明猪牙髓细胞中可以分离得到具有多向分化能力的SP细胞，人牙髓细胞，牙周细胞中也检测到少量SP表型。　　 本研究的目的旨在对人牙髓细胞进行SP表型鉴定，探讨体外缺血培养对牙髓SP表型的影响。分离培养人牙髓SP细胞，体外诱导其向成牙本质/成骨、成脂、成神经、成血管内皮方向分化，并检测牙髓SP细胞的生物学特性，为SP分选应用于人牙髓干细胞的分离和纯化奠定基础。　　 第一章：人牙髓细胞体外培养及SP鉴定。　　 目的：从人健康恒牙及乳牙牙髓组织中分离、培养牙髓细胞，检测第2代DPCs中SP含量，ABCG2的表达情况，结合ABCG2在牙髓组织中的定位，分析ABCG2表达对维持牙髓SP细胞表型所起作用。　　 方法：酶消化法原代培养人恒牙及乳牙牙髓细胞。Hoechst33342染色后，流式细胞仪检测恒牙牙髓细胞和乳牙牙髓细胞中SP比例。用ABCG2抗体进行免疫荧光染色，定位ABCG2在人牙髓细胞中的表达。采用荧光定量RT-PCR检测两种细胞中ABCG2基因表达水平。免疫组化染色确定ABCG2在正常和炎症牙髓组织中的表达。　　 结果：体外培养的恒牙和乳牙牙髓细胞中均检测到SP细胞，其中恒牙SP比例约占1％，乳牙SP约为2％。免疫荧光结果显示ABCG2表达在牙髓细胞的胞膜。荧光定量RT-PCR检测到两种牙髓细胞均有ABCG2基因表达，其中乳牙牙髓细胞略高于恒牙牙髓细胞(p＜0.05)。免疫组化染色显示ABCG2在正常牙髓中主要表达于血管周和成牙本质细胞层，而在炎症牙髓组织中可见ABCG2+细胞增多。　　 结论：人恒牙和乳牙牙髓细胞中均可检测到SP细胞及其标志物ABCG2的表达，其中乳牙牙髓SP比例稍高。ABCG2在正常牙髓组织定位于血管周和成牙本质细胞层，炎症牙髓组织中ABCG2表达增高。　　 第二章：体外缺血培养对牙髓SP的影响。　　 目的：本部分将在体外模拟缺血培养牙髓细胞，检测缺血培养对牙髓SP表型，SP标志ABCG2及干细胞标志Oct4的影响。　　 方法：确定体外模拟缺血条件(2％O2 and2％FBS)，实验分三组：正常组，24h缺血组，48h缺血组。MTT法检测缺血培养对牙髓细胞增殖的影响。流式细胞仪检测正常组，24h和48h缺血组SP细胞比例。细胞免疫荧光检测三个实验组中ABCG2与Oct4的蛋白表达。荧光定量RT-PCR检测各组ABCG2和Oct4mRNA表达。　　 结果：MTT检测数据显示从5-7天开始，缺血组细胞增殖与正常组相比呈明显抑制趋势(p＜0.05)，尤其是48h缺血组(p＜0.01)。流式检测发现不同培养条件下牙髓细胞中SP含量明显不同，缺血组SP比例较正常组增高。其中48h缺血组中SP细胞的含量约为5％，24h缺血组中含2％SP细胞，而对照组中仅有1％。细胞免疫荧光结果提示24h和48h缺血组中ABCG2+、Oct4+细胞较正常组增多，其中24h缺血组ABCG2+细胞数与正常组相比差异有统计学意义(p＜0.05)，48h缺血组与正常组相比差异更显著(p＜0.01)，同时48h缺血组Oct4+细胞数与正常组相比差异也较显著(p＜0.01)。荧光定量RT-PCR结果显示48h缺血组ABCG2和Oct4基因表达水平均明显高于其余两组(p＜0.01)。　　 结论：短期体外缺血培养可以促进人牙髓SP细胞及其标志物ABCG2的表达。同时还可提高干细胞标志Oct4的表达。　　 第三章：牙髓SP细胞体外多向分化能力检测。　　 目的：通过流式分选得到人牙髓SP及MP细胞，并进行体外多向分化(成牙本质/成骨，成脂，成神经，成血管内皮)诱导，观察牙髓SP细胞是否具有良好的多向分化潜能。　　 方法：通过流式细胞仪分离获得牙髓SP和MP细胞。体外诱导牙髓SP和MP细胞向成牙本质/成骨分化，诱导14d后，茜素红染色观察矿化基质的形成。荧光定量RT-PCR检测成牙本质/成骨标志基因DSPP，DMP-1的表达。体外诱导牙髓SP和MP细胞向成脂分化，培养21d后，油红O染色。荧光定量RT-PCR检测成脂标志基因PPARγ2与LPL表达。体外诱导牙髓SP和MP细胞神经分化，诱导培养4天后，细胞免疫荧光法检测NSE表达。荧光定量RT-PCR检测神经细胞标志基因NSE和NEF的表达。体外诱导牙髓SP和MP细胞向血管内皮分化，分化培养7天的细胞进行Matrivgel管状形成试验，荧光定量RT-PCR检测内皮细胞标志基因vWF，CD31的表达。　　 结果：成牙本质/成骨诱导：茜素红染色显示SP细胞诱导两周后形成的矿化基质较MP细胞多，相关基因DSPP与DMP-1的表达量SP细胞明显高于MP细胞(p＜0.01)。成脂诱导分化：油红O染色显示SP细胞诱导三周后形成细胞内脂滴较MP细胞大且多，相关基因PPARγ2与LPL的表达量SP细胞明显高于MP细胞(p＜0.01)。成神经诱导分化：诱导2d后SP细胞发生极化，细胞突起形成，诱导4d后免疫荧光染色显示SP细胞NSE呈强阳性，MP细胞表达阴性。成神经诱导后相关基因NSE与NEF的表达量SP细胞明显高于MP细胞(p＜0.01)。成血管内皮诱导分化：诱导7d后SP细胞在Matrivgel胶上形成二维网状结构，MP细胞未见成管。成血管内皮诱导后相关基因vWF与CD31的表达量SP细胞明显高于MP细胞(p＜0.01)。　　 结论：人牙髓SP细胞在体外具备成牙本质/成骨、成脂、成神经和成内皮的多向分化潜能，有望成为组织工程新的种子细胞。　　 第四章：人牙髓SP细胞生物学特性研究。　　 目的：为进一步证实人牙髓SP细胞的干细胞特性，本实验对分离得到的SP和MP细胞进行了相关的生物学特性检测，包括克隆形成实验、干细胞相关基因表达检测以及SP细胞长期分化实验。　　 方法：通过流式细胞仪分离获得牙髓SP和MP细胞。克隆形成实验检测牙髓SP和MP细胞克隆形成能力。荧光定量RT-PCR检测七个干细胞相关基因在SP和MP细胞表达水平。收集分选后传至第三代，第六代和第九代的SP细胞，通过流式细胞仪和Western Blot检测ABCG2蛋白表达，实时荧光定量RT-PCR检测ABCG2基因表达。　　 结果：SP细胞的集落形成率(5.3士0.8)％，明显高于MP细胞(0.6士0.2)％(p＜0.01)。荧光定量RT-PCR检测结果显示7个干细胞相关基因Tert，SDF-1，α-SMA，Oct4，Bmil，CD146和Stat3在人牙髓SP细胞中的表达远远高于MP细胞。流式细胞仪对第三代，第六代和第九代人牙髓SP细胞表面ABCG2表达分析，结果显示随传代次数增加细胞表面ABCG2蛋白表达量逐渐减少。Western blot结果也证实ABCG2蛋白在SP细胞传代过程中各时相表达有差异。荧光定量PCR结果表明各代SP细胞ABCG2mRNA变化趋势与ABCG2蛋白基本一致。　　 结论：人牙髓SP细胞具有干细胞特性，但在传代过程中SP表型逐渐丧失，提示目前培养条件不能有效维持牙髓SP细胞的干细胞特性。