背景 EBV是一种普遍存在的疱疹病毒，主要感染人类B细胞及口咽部粘膜上皮细胞，与淋巴瘤和鼻咽癌密切相关。目前感染B细胞的分子机制己清楚，但感染上皮细胞的分子机制还不完全清楚。研究EBV感染细胞的分子机制，对EBV感染的预防和干预具有重要意义。已有报道指出，携带EBV的细胞与上皮细胞的紧密接触，可显著促进EBV感染上皮细胞，但何种携带EBV细胞通过什么机制感染上皮细胞的还不清楚。最新研究表明B细胞是EBV感染上皮细胞的传递载体，但机制尚不清楚。我们在用DC标志物DC-SIGN的单抗免疫组化检测鼻咽癌病人发现鼻咽粘膜下存在许多DC。众所周知，未成熟DC是一线最强的外来微生物捕获哨兵，并且有文献报道，EBV能够感染未成熟的DC。但DC上何种受体与EBV结合尚不清楚。本课题所研究的DC—SIGN是DC上多种病原微生物的受体，包括HIV、HCV、CMV、HHV8。并且DC-SIGN在HIV和HHV8在通过B淋巴细胞感染靶细胞过程中是必需的。本研究的目的是验证未成熟DC上DC-SIGN是否是EBV的受体，并了解在EBV通过B淋巴细胞膜表面作为中间载体反式感染上皮细胞过程中DC-SIGN是否扮演重要角色。 目的 1、探讨DC-SIGN是否是DC上潜在的EB病毒受体 2、了解在EBV通过B淋巴细胞膜表面作为中问载体反式感染上皮细胞过程中DC-SIGN是否扮演重要角色 材料和方法 1、细胞培养：通过Akata EBV(+)细胞制备EBV，并建立EBV阳性的AGS胃癌细胞株和外源性稳定高表达DC-SIGN的293FT细胞株。 2、免疫组化：通过Anti-DC-SIGN单抗免疫组织化学检测鼻咽粘膜下是否存在高表达DC-SIGN的DC。 3、RT-PCR:通过胎盘提取mRNA，RT-PCR获取目的基因DC-SIGN，以构建pcDNA3.1-DC-SIGN载体。 4、Flow cytometry和Western blots：Western blots检测DC-SIGN蛋白水平的表达，同时通过Flow cytometry检测DC-SIGN，EBV-GFP和其他相关分子标记物表达。 5、DC的体外培养、分化和鉴定：从外周血分离出单个核细胞加入含有rhGM-CSF1000 U/ml、rhIL-4 1000 U/ml的含10％自体血清的1640培养液诱导未成熟DC，并通过显微镜和流式细胞仪(用DC标志物单抗)监测和鉴定。 6、免疫荧光：检测在EBV-GFP感染293FT-DC．SIGN后DC-SIGN和EBV-GFP的共定位情况。 7、EBV Infection和DC-SIGN单抗中和抑制实验和甘露聚糖EGTA的竞争抑制实验：在加EBV-GFP感染以前，各组细胞分别加入20μg/ml DC-SIGN单抗；100μg/ml甘露聚糖；5mM EGTA在4℃作用1 h，再加EBV-GFP感染，流式检测病毒感染率，荧光定量PCR检测EBV DNA。 8、免疫磁珠分离B淋巴细胞：通过免疫磁珠从外周血分离出B淋巴细胞，流式细胞检测B细胞标志，鉴定B的纯度，并确定EBV感染B淋巴细胞和LCL是否上调DC-SIGN的表达。 结果 1.EBV的制备及定量定性检测通过大量培养Akata EBV(+)并加入兔或羊抗人IgG使EBV从潜伏期表达进入裂解期表达，释放病毒，得到细胞上清并通过高速离心制备EBV。并通过流式检测EBV感染Akata EBV(一)的感染效率，同时通过荧光定时PCR检测EBV的DNA拷贝数，建立了EBV定量定性的方法。建立了EBV阳性的AGS细胞株，并制得上皮细胞来源的EBV。 2.建立稳定表达DC-SIGN的293FT细胞从胎盘mRNA中，RT-PCR扩增DC-SIGN的编码区，克隆入pcDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-DC-SIGN真核表达载体。293FT细胞铺六孔板，质粒用Lipofectamine 2000，转染293FT细胞，转染后48 h，换含G418(800 μg/ml)，10％FCS的DMEM培养基培养两周。同时用空质粒pcDNA3.1转染293FT细胞，作为阴性对照。通过流式、Western blots和免疫荧光证实建立了稳定表达DC-SIGN的293FT细胞。 3.DC-SIGN是DC上潜在的EB病毒受体EBV-GFP感染293FT-DC-SIGN，同时与未转染DC-SIGN的293FT细胞比较，发现293FT-DC-SIGN组感染率为67.5％，而对照组为3.7％；293FT-DC-SIGN组感染率约是对照组的20多倍；而加入DC-SIGN抗体中和EBV-GFP感染293FT-DC-SIGN，其感染率均明显下降，同时用Mannan竞争抑制和EGTA络合抑制EBV-GFP感染293FT-DC-SIGN，其感染率均明显下降。EBV-GFP感染外周血单核细胞制备DC，荧光定量PCR结果显示EBV-GFP感染了DC。上述结果提示DC-SIGN介导EBV感染DC。 4.EBV感染B淋巴细胞及LCL上调DC-SIGN的表达EBV感染B淋巴细胞(未刺激组)和B淋巴细胞(IL-4和CD40L刺激组)均可上调DE-SIGN的表达；EBV感染LCL(Akata EBV(-)和Raji细胞)之后也可检测到DC-SIGN表达的上调。EBV感染靶细胞之后第一天就可检测到DC-SIGN表达的上调。 结论 1.系统地总结了EBV制备的方法，建立了由Akata EBV(+)细胞和表达EBV的AGS细胞株制备EBV的成熟稳定的方法，确立了标准的EBV定量定性方法。 2.本实验初步证实DC细胞膜上DC-SIGN是EBV受体，将有助于揭开EBV感染DC的分子机制和阐明EBV在人群间通过唾液传播的分子机理。 3.EBV感染B淋巴细胞及LCL后可能通过LMP1上调DC-SGIN，我们有理由推测DC—SIGN在EBV感染上皮细胞中扮演着重要角色