磷脂酰肌醇激酶在许多人类疾病如癌症、疟疾、阿尔兹海默症和糖尿病中都有重要的功能。在磷脂酰肌醇激酶中，磷脂酰肌醇4位激酶Ⅱ型α亚型(PI4KⅡα)主要定位在反式高尔基体网络和内涵体中。我们实验室报道了PI4KⅡα的高表达会促进肿瘤的生长，建立了以PI4KⅡα与EGFR双靶点联合抗肿瘤的新策略。然而PI4KⅡα的基础研究和临床应用却因为缺少其特异性抑制剂受到限制。已有大量的PIK家族抑制剂被发现，但是绝大多数是PI3K的ATP竞争性抑制剂。因为PIK家族各亚型激酶核酸结合口袋氨基酸序列的高度保守性，大多数ATP竞争抑制剂不具有亚型选择性抑制。我们通过已解析的PI4KⅡα结构，分子动力学模拟以及位点突变实验确定了PI4KⅡα的底物磷脂酰肌醇(PI)结合口袋。PI结合口袋由棕榈酰化插入片段和活化环上氨基酸组成。PI4KⅡα的棕榈酰化插入片段在其他PIK家族激酶中不存在，该插入片段是筛选PI4KⅡα特异抑制剂的理想作用位点。这使得筛选PI4KⅡα的特异底物竞争性抑制剂成为可能。　　本课题采用配体对接的虚拟筛选策略进行PI4KⅡα抑制剂的筛选。经过两轮候选化合物对体外和细胞内PI4KⅡα激酶活性抑制效果的筛选，发现2-（3-（4-氯苯甲酰）硫脲）-4-乙烷-5-甲基噻吩-3-酰胺（PI-273）对PI4KⅡα有最好的抑制效果，PI-273对PI4KⅡα蛋白的半数抑制浓度为0.47μM，对多种乳腺癌细胞系的细胞增殖有显著抑制效果。表面等离子共振实验和蛋白热稳定实验表明PI-273可以直接与PI4KⅡα有相互作用。酶动力学分析显示，与其他绝大部分的结合在激酶ATP位点的PIK激酶家族抑制剂不同，PI-273是PI4KⅡα的可逆的与其底物PI竞争性结合的抑制剂。位点突变分析表明PI4KⅡα的棕榈酰化插入片段对PI-273的选择性有重要作用。激酶选择性作用谱实验表明PI-273对PI4KⅡα具有很强的选择性。利用CRISPR/Cas9技术构建敲除PMKⅡα的细胞系，发现PI-273对敲除PI4KⅡα的细胞系细胞增殖和PI4KⅡα下游信号通路抑制作用减弱，说明PI4KⅡα是PI-273的特异性作用靶点。进一步机制研究表明PI-273可以通过阻碍细胞周期G2/M期而抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制癌细胞成克隆能力。在小鼠移植瘤模型中，PI-273可以显著的抑制MCF-7乳腺癌细胞诱导的小鼠肿瘤的生长，并对小鼠无毒副作用。　　综上所述，我们发现了PI4KⅡα的第一个亚型特异小分子抑制剂PI-273。 PI-273是PI4KⅡα底物PI的竞争性抑制剂，与绝大多数激酶的ATP竞争性抑制剂不同，PI-273具有更高的亚型选择性。该抑制剂通过与PI4KⅡα直接相互作用而抑制PI4KⅡα的酶活性进而抑制乳腺癌肿瘤的生长。PI-273的发现对于促进PI4KⅡα基础科学研究和应用具有重要意义。此外，我们对PI4KⅡα在酶活性调控机制和肿瘤转移中的功能也进行了相关探索。