研究背景与目的:血管内再狭窄是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后,血管内皮创伤而再次发生管腔狭窄、阻塞的病理过程。尽管随着药物支架和药物球囊的出现使再狭窄发生率从最初的10%-30%降低至目前的5%左右,大大改善了冠心病患者预后,使冠心病的治疗发生里程碑式改变,但再狭窄的防治始终未获得突破性进展,特别是在糖尿病和复杂病变如弥漫病变、小血管、分叉病变等尤为突出,再狭窄率可达20%以上,并且药物洗脱支架或球囊并不能用于治疗所有的新生内膜斑块的形成。因此,解决血管内再狭窄成为刻不容缓的重大课题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种多能干细胞,他们可以从大量的结缔组织中获得,如:骨髓,脂肪、脐带血等,具有自我更新的特性,可分化为多种类型的细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMC)等。MSC多能分化及易于扩大培养的特性使得其治疗研究倍受关注。作为细胞之间传递功能物质的桥梁,外泌体在细胞间相互作用的微环境中受到越来越广泛的重视。外泌体作为MSC分泌的膜包裹囊泡,不但优于MSC的特性,而且大大降低了MSC的移植风险,如低存活率、免疫排斥、以及致畸致瘤等,并且具有更稳定、易储存、低免疫原性、低风险的特点。因此间充质干细胞外泌体(exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-Exo)在修复损伤组织或器官、抑制炎性、免疫调节相关研究方面日益增加。骨髓MSC已显示出通过促进损伤血管的重新内皮化抑制新生内膜的形成,人类MSC也显示可以通过减少炎症反应而具有治疗作用。此外,MSC-Exo能够介导细胞与其靶细胞之间的细胞间通讯,并且通过mi R-125b抑制血管损伤后新生内膜的形成。然而,目前尚未完全阐述MSC-Exo对血管损伤后新内膜形成的作用及确切机制。为了分析MSC-Exo对血管损伤后新生内膜形成的影响及相关机制,本研究过程中,引入MSC-Exo,体外分析MSC-Exo对内皮细胞(endothelial cells,EC)增殖和迁移的影响及相关机制,体内通过构建球囊诱导的大鼠颈动脉损伤模型,了解血管损伤后,外源性注入MSC-Exo是否可以向血管损伤区域定向聚集、靶向归巢,乃至对血管损伤后新生内膜形成产生何种影响及其可能作用机制。研究方法:1.MSC-Exo的分离提取与生物学特征从大鼠骨髓中分离提取MSC,通过显微镜观察和流式细胞术鉴定细胞表面抗原两个方法鉴定培养细胞,利用外泌体纯化试剂盒分离MSC培养上清中外泌体,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)和蛋白免疫印迹(western blot)方法鉴定提取外泌体的生物学特征,将PKH67标记的外泌体与EC共培养,通过共聚焦电子显微镜检测EC对外泌体的摄取情况。2.MSC-Exo对EC增殖和迁移的影响及相关机制为了检测MSC-Exo对EC增殖的影响,将EC分为对照(Control)组、MSC培养上清(MSC-CM)组、EC培养上清(EC-CM)组、MSC-Exo组和去除MSC-Exo的MSC培养上清(CM-Exo-free)组,通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK8)和细胞免疫荧光检测它们对EC增殖的影响,通过将MSC-Exo分别稀释成0μg/m L、0.1μg/m L、1μg/m L、10μg/m L和100μg/m L与EC共培养,CCK8检测对EC增殖的影响。通过western blot检测MSC-Exo对EC增殖相关蛋白:增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达的影响。为了检测MSC-Exo对EC迁移的影响,将EC分为Control组和MSC-Exo组,通过细胞划痕检测MSC-Exo对EC迁移的影响。通过western blot检测MSC-Exo对EC迁移相关蛋白:波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)表达的影响。为了进一步分析Erk1/2信号通路对EC增殖和迁移的影响,将EC分为MSC-Exo组、MSC-Exo+DMSO组和MSC-Exo+SCH772984(Erk1/2抑制剂)组,通过CCK8、细胞免疫荧光和细胞划痕检测它们对EC增殖和迁移的影响,通过western blot检测EC中PCNA、Cyclin D1、MMP2、MMP9、Vimentin、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,Erk1/2)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases 1/2,P-Erk1/2)表达的变化。3.MSC-Exo对血管损伤后新生内膜形成的影响及相关机制通过建立球囊诱导的大鼠颈动脉损伤模型,将大鼠分为假手术组、生理盐水组和MSC-Exo组,尾静脉注射生理盐水或MSC-Exo,假手术组不作处理,注射周期为2周或4周。通过伊文思蓝染色检测MSC-Exo对损伤血管的重新内皮化影响,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色和Masson染色检测MSC-Exo对血管损伤后新生内膜增生的影响,通过免疫组化和免疫荧光检测MSC-Exo对血管生成相关蛋白:血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)和血管性血友病因子(von willebrand factor,v WF)及平滑肌细胞特异性蛋白:α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响。研究结果:1.MSC-Exo的生物学特征通过流式细胞术分析MSC表面标志物:CD29、CD90和CD11b的表达,结果显示,CD29的阳性率为99.6%,CD90的阳性率为99.8%,而CD11b的阳性率为0.17%,因此可判定提取的细胞为MSC。通过TEM、NTA和western blot分析发现,提取的外泌体粒径大小在30-150nm之间,且主要集中在110nm左右,形状呈椭圆形、盘状,对CD63、肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、热休克蛋白(heat shock proteins 70,HSP70)和CD81都有表达,而不表达钙连蛋白(Calnexin),结果提示MSC-Exo提取成功。通过外泌体摄取实验分析,PKH67标记的MSC-Exo在EC细胞核周围出现,暗示了MSC-Exo能够被EC所摄取。2.MSC-Exo促进EC的增殖和迁移CCK8结果显示MSC培养上清促进EC增殖,并且依赖时间增加,而EC上清处理的EC与对照组几乎没有区别,对EC的增殖无影响。在0-100μg/m L之间,MSC-Exo都能促进EC增殖,且在浓度为10μg/m L时,MSC-Exo促增殖效果最佳。与对照组相比,MSC-Exo促进EC增殖,而去除外泌体的MSC培养上清与对照组几乎无差异,对EC的增殖无影响。western blot结果显示MSC-Exo能够上调PCNA和Cyclin D1的表达。同时,免疫荧光显示MSC-Exo增加EC Ki67的阳性率。为了分析MSC-Exo对EC迁移的影响,细胞划痕结果显示MSC-Exo促进EC的迁移。进一步对迁移相关蛋白表达的分析,western blot结果显示MSC-Exo显著上调Vimentin、MMP2和MMP9的表达。3.MSC-Exo激活Erk1/2信号通路western blot结果显示MSC-Exo显著上调P-Erk1/2的表达,而显著下调Erk1/2的表达,提示MSC-Exo激活了Erk1/2信号通路。此外,western blot结果还显示SCH772984能够阻断Erk1/2信号通路。CCK8结果显示,与MSC-Exo和MSC-Exo/DMSO组相比,SCH772984的添加显著抑制了MSC-Exo对EC的增殖和迁移作用。免疫荧光结果也显示MSC-Exo增加的Ki67阳性率被SCH772984显著抑制。western blot结果显示,与MSC-Exo和MSC-Exo/DMSO组相比,SCH772984的加入显著下调PCNA、Cyclin D1、MMP2、MMP9和Vimentin的表达。4.MSC-Exo抑制血管损伤后新生内膜的形成伊文思蓝染色结果显示,连续注射两周后,与生理盐水组相比,MSC-Exo能够促进血管损伤后的重新内皮化。而连续注射四周后,MSC-Exo组与生理盐水组的内皮化率差异不显著。H&E染色结果发现,与假手术组相比,生理盐水治疗显著增加新生内膜与中膜的比例(I/M)、新生内膜面积、中膜面积和胶原面积,且治疗四周后新生内膜与中膜的比例、新生内膜面积、中膜面积和胶原面积更大。通过MSC-Exo连续注射治疗能大大减轻新生内膜增生的情况,如:I/M、新生内膜面积、中膜面积和胶原面积的减少,且连续四周治疗后效果更佳。免疫组化结果显示,与假手术组相比,生理盐水治疗显著上调α-SMA的表达,下调CD31和v WF的表达,而MSC-Exo治疗后,α-SMA的表达显著下调,而CD31和v WF的表达显著上调。免疫荧光结果显示,与假手术组相比,生理盐水组CD31和v WF的荧光强度显著减弱,而经过MSC-Exo治疗后,CD31和v WF的荧光强度显著增强,提示MSC-Exo能够显著上调CD31和v WF的表达。研究结论:由体外实验得出MSC-Exo通过激活Erk1/2信号通路促进EC的增殖和迁移,并上调增殖和迁移相关蛋白的表达;体内实验得出MSC-Exo促进损伤血管的重新内皮化,上调CD31和v WF的表达,下调α-SMA的表达,抑制新生内膜的形成。综上所述,MSC-Exo通过激活Erk1/2信号通路抑制血管损伤后新生内膜的形成。