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新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽的一种急性、热性、高度接触性传染病,主要引起呼吸道、消化道的损伤。新城疫病毒属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属,为单股负链不分节段的RNA病毒。目前已知包括NDV在内的副黏病毒,除了可以通过自身的囊膜与细胞质膜融合进入宿主细胞外,还可以直接利用细胞的内吞作用来感染宿主,例如NDV可通过小窝蛋白介导的内吞途径进入HeLa细胞,但是其针对不同细胞可能利用不同感染策略,本研究选择DF1细胞以及DCs作为研究对象,采用多种实验方法验证NDV感染细胞的情况。一、网格蛋白、dynamin和胆固醇在NDV感染细胞中的作用用ZJ1株感染DF1细胞和DCs,确定NDV感染细胞周期为4h。用CPZ、dynasore、MβCD分别处理细胞,实验发现CPZ和dynasore处理后细胞中NP蛋白表达水平以及细胞上清的病毒滴度显著下降(p<0.05),而MβCD处理组细胞中NP蛋白表达水平没有出现变化。利用siRNA干扰细胞中的网格蛋白表达,发现细胞中NP蛋白表达水平显著下降(p<0.05)。实验发现抑制细胞网格蛋白的表达和dynamin的活性,病毒感染出现下降,但是去除胆固醇不能抑制病毒的感染。以上结果说明NDV感染DF1细胞和DCs依赖CME途径而不依赖胆固醇。二、巨胞饮途径在NDV感染细胞中的作用本实验选择F-actin聚合作用药物抑制剂Cyto D和稳定剂Jasplakinolide,以及抑制Na~+/H~+交换(NHE)抑制剂EIPA分别处理DF1细胞和DCs,说明NDV感染需要F-actin的重排以及Na~+/H~+交换。利用PI3K抑制剂wortmannin处理细胞后发现DF1细胞中NP蛋白表达水平以及细胞上清中的病毒滴度无显著变化,但是在DCs中出现了抑制作用;利用PKC抑制剂Rottlerin以及PKC激活剂PMA预处理细胞,发现Rottlerin处理细胞后NP蛋白表达水平下降,而PMA处理的细胞中NP蛋白表达水平增加,说明病毒感染细胞激活PKC。在病毒感染细胞早期,发现激活的Rac1以及磷酸化状态的Pak1表达量均上调并且趋势相同,Rac1抑制剂处理后细胞中NP蛋白表达水平以及细胞上清中的病毒滴度显著减少(p<0.05),说明病毒进入细胞后激活Rac1-Pak1信号通路,进而证明NDV可以通过巨胞饮途径感染DF1细胞和DCs。三、NDV在细胞中的转运过程构建获得Rab5a和Rab7的野生型和显性失活突变体质粒,Western Blot检测发现过表达Rab5a显性失活突变体的DF1细胞中NP蛋白表达水平显著减少(p<0.05),过表达Rab5a野生型的细胞中NP蛋白表达水平显著增加(p<0.05),而过表达Rab7野生型及其突变体的细胞中NP蛋白表达水平没有变化。间接免疫荧光实验发现,NDV感染DF1细胞后NP蛋白在早期内体中大量聚集并与早期内体的标志蛋白EEA1发生共定位,而与晚期内体的标志蛋白LAMP1无明显共定位,说明NDV进入DF1细胞后在早期内体完成脱衣壳。综合上述研究发现NDV可以利用网格蛋白介导的内吞途径以及巨胞饮途径感染DF1细胞和DCs,此研究结果对NDV感染细胞的分子机制提出新的见解,从而为NDV的防控提供新的思路和想法。