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花生是我国重要的油料作物之一,在我国的国民经济中发挥重要的作用。花生是植物界为数不多的地上开花地下结果的植物之一。花生的果针是指花生胚珠受精后子房柄向下伸长的部分,其携带着受精胚珠向下生长,入土后果柄停止生长,胚珠开始发育成为成熟的荚果。果针是花生生长发育过程一个重要器官,其向地性的这一特殊的生物学特性引起众多学者的关注。但目前有关果针向地性的机理尚不清楚,而且国内有关这方面的研究也鲜有报道。 本研究以授粉后12-15天的果针为材料,采用离体培养的方式,通过比较正置果针和倒置果针在离体培养的早期阶段果针向地性弯曲部位细胞结构,内源激素,基因和蛋白质表达谱的等方面的差异,研究果针向地性弯曲的可能分子机制,并从中鉴定和筛选出与花生果针向地性相关的基因和蛋白质,为下一步揭示花生果针向地性机理,分离向地性相关基因打下基础。研究结果显示: 1、果针离体培养试验表明:不论果针以什么角度插入无激素的MS培养基,离体培养6h后,其尖端均能感受到重力的影响而发生弯曲,并呈向地生长趋势。 2、观察果针细胞的结构,结果显示:果针的13个维管束围绕于皮层细胞和中心细胞髓之间,其排列方式与典型的双子叶植物茎相同。细胞结构的观察结果表明,果针的弯曲伸长部位距果针顶端1-3mm处,该部位的居间分生组织呈“H”状。花生果针是生殖器官,行为似根,是一个植物学上具有特殊的解剖结构和形态特征的器官。 3、采用石蜡切片方法,比较倒置离体培养果针的弯曲部位和正置离体培养果针相应部位(不弯曲)的细胞结构,结果表明:两者最大的差异存淀粉粒的排列方式。正置果针的淀粉粒主要沉积于皮层细胞的底部,在生长的过程中,淀粉粒排列方式没有发生变化;而倒置果针弯曲部位皮层细胞中的淀粉粒移动到弯曲部位的细胞侧壁上,而且随着弯曲程度的增加,淀粉粒在细胞侧壁沉积程度也在增加。 4、采用HPLC的方法,比较正置和倒置果针离体培养6h和12h时果针主要内源激素的变化,结果显示:正置培养果针在离体生长过程GA3,IAA和CTK的浓度逐渐下降,而倒置培养果针在离体生长过程IAA浓度变化不大,但GA3和CTK深度显著增加:与此相反,ABA的浓度在正置离体培养果针的生长过程中是逐渐增加,而倒置培养是逐渐减少。 5、采用蛋白质组学方法,比较正置和倒置果针离体培养6h和12h时果针弯曲部位蛋白表达差异,结果表明:相对于正置培养,倒置果针离体在发生弯曲时,共有13个蛋白点发生显著变化,其中特异表达,上调表达,下调表达和不表达的蛋白点分别为5,4,3和1个,MALDI-TOF-MS分析结果显示这些蛋白质分别是Arah8allergenisoform3,classⅢacidicendochitinase,chloridechannel,glycine-richRNA-bindingprotein,pathogenesis-relatedclass10protein,voltage-dependentanionchannel,kunitztrypsinproteaseinhibitor,gammacarbonicanhydrase1,germin-likeproteinsubfamily3member3precursor,GibberellinreceotorGID1等。对13个差异表达蛋白质的相应基因表达进行实时定量RT-PCR分析,结果表明:13个基因中,ClassⅢacidicendochitinase(P1521),Kunitztrypsinproteaseinhibitor(P1054和P1126为两个多态性蛋白),chloridechannel(P1302)和Pathogenesis-relatedclass10protein(P1487)等5个蛋白的表达在正置与倒置培养之间存在较大差异。蛋白质组研究结果表明,这5个基因的表达与果针的向地性弯曲有关。 6.采用高密度花生基因表达谱芯片比较正置与倒置离体培养花生果针弯曲部位的基因表达的差异,结果表明:相对于正置培养,离体培养6h,倒置离体果针共有280个基因差异表达,其中上调表达138个,下调表达142个;离体培养12h,倒置离体共有678个基因差异表达,其中上调表达207个,下调表达471个。在离体培养6h和12h,共有9个基因同时出现表达差异,其中上调基因有2个,同时下调基因有7个。基因功能注释显示,这些差异表达基因主要包括氧化还原相关基因,碳水化合物运输相关基因,微管相关基因和磷脂酰肌醇途径相关基因,初步推测这些基因可能参与花生果针向地性弯曲生长过程。为验证基因芯片数据的可靠性和重复性,选择5个差异表达基因进行实时定量PCR分析,其结果与芯片检测结果基本吻合。