论文部分内容阅读
研究背景阿尔茨海默病(AD)是最常见的老年期痴呆，随着年龄的增长发病率明显升高。AD可分为家族性(FAD)和散发性(SAD)两种类型，早老素1(PS1)基因异常是引起FAD的主要原因。本课题组最近在世界上首先报道了两个中国人FAD家系中中所发现的PS1基因错义突变：Val97Leu和Ala136Gly，两个突变位点所在的密码子编码的都是重要的蛋白功能区，提示基因突变的结果可能导致PS1蛋白功能的异常。
AD是多基因、多因素引起的复杂疾病，发病机制尚不明确。研究发现，大部分PS1基因突变可使神经元细胞产生Aβ42增加，在AD患者的脑组织中Aβ42是老年斑(SP)中淀粉样蛋白核心的主要成分，SP的周边还可见到大量激活的神经胶质细胞、炎症因子，以及少量变性坏死的神经元和突触。神经胶质细胞在Aβ的作用下可分泌大量炎症介质，包括白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等。这些炎症介质又可以进一步促进神经元产生更多的A。有假说认为，这种神经元和神经胶质细胞之间的相互作用，对脑组织中的炎症反应起到加强的作用，这种不断被加强的炎症反应可能是导致AD神经元变性和慢性病程的原理。FAD中PS1基因突变对神经元和胶质细胞之间炎症反应过程的影响尚未见报道。
本研究通过基因转染方法使人神经母细胞瘤SY5Y细胞表达野生型(wt)或突变型(mt)PS1基因，在SY5Y和人神经胶质瘤U251细胞之间建立起相互作用的体系，观察Val97Leu和Ala136Gly两种PS1突变基因对该体系中SY5Y细胞活性的影响。
研究方法采用定点突变技术制作含有Val97Leu和Ala136Gly突变基因的pcDNA3.1/PS1mt质粒，通过DNA连接方法构建pcDNA3.1/PS1wt/mt与增强绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体pcDNA3.1-EGFP/PS1wt/mt，转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)。用表达PS1wt/mt基因的SY5Y细胞培养上清激活人胶质瘤细胞(U251)，孵育48h后取U251细胞培养上清(CM-U)，作用于培养的非转染SY5Y细胞。根据转染质粒的不同，将CM-U作用下的SY5Y细胞分为4组：野生型(wt)、突变型(Val97Leu)、突变型(Ala136Gly)和空载(mock)转染组。AnnexinV-FITC和碘化丙锭(PI)双染结合流式细胞仪分析，计算不同转染组SY5Y细胞在顺铂(100μg/ml)诱导下凋亡细胞百分比的变化；酶连免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中炎症反应因子的含量；放免法分析细胞外Aβ的总量。
结果1.制作含有Val97Leu和Ala136Gly两种PS1基因突变的质粒采用定点突变技术，将PS1基因4号外显子289位点的核苷酸G诱导突变为T，5号外显子407位点的核苷酸C诱导突变为G。制成的质粒DNA用pcDNA3.1/PS1G289T，pcDNA3.1/PS1C407G表示。DNA测序结果证实点突变成功。
2.构建PS1和EGFP基因共表达质粒采用PCR法从pEGFP-C1质粒获得两端分别含有BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切位点的EGFP基因片段，在同样的酶切位点切开DNA载体pcDNA3.1/PS1。将EGFP基因片段插入PS1基因前，制成共表达质粒pcDNA3.1-EGFP/PS1，使EGFP可以定性、定量地报告PS1基因的表达情况。DNA测序证实PS1与EGFP共表达载体构建成功。
3.pcDNA3.1-EGFP/PS1wt/mt转染SH-SY5Y细胞的鉴定SH-SY5Y细胞在转染后48h，荧光显微镜下可观察到EGFP表达阳性的细胞。进一步提取细胞蛋白，用Westernblot检测转染细胞中PS1的表达。在wt、G289T、C407G转染的细胞中有明显的PS1表达，而非转染和mock转染的细胞中仅有微量的PS1表达。
4.在SY5Y与U251细胞相互作用的过程中，PS1突变基因(Val97Leu,Ala136Gly)对细胞凋亡、炎症介质和Aβ产生的影响4.1对顺铂诱导的SY5Y细胞凋亡的影响取CM-U与细胞凋亡诱导剂顺铂(100μg/ml)同时加入培养的非转染SY5Y细胞，孵育10h后检测细胞凋亡。AnnexinV-FITC和PI双染可特异性区分正常细胞、凋亡细胞与坏死细胞。流式细胞仪检测凋亡细胞的比例发现，与wt组(22.9±1.8)相比，Val97Leu(13.1±1.4)和Ala136Gly(16.5±0.6)组的凋亡细胞比例显著降低(P＜0.01)，而mock(18.9±1.8)与wt组的比例则无明显差异(P＞0.05)4.2SY5Y细胞培养上清中炎症介质的检测取CM-U加入正常的SY5Y细胞中孵育72h，检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的含量。ELISA检测结果发现，与wt组产生的IL-1β(5.94±0.43pg/ml)相比，Val97Leu组IL-1β的产生量显著降低(3.90±0.22pg/ml，P＜0.01)，Ala136Gly组也有明显降低(4.13±0.83pg/ml，P＜0.05)，而mock组(6.15±0.58pg/ml)与wt组无显著性差异(P＞0.05)。细胞培养上清中TNF-α、NO、iNOS、MCP-1的含量在各组之间没有明显差别。4.3对SY5Y细胞分泌Aβ的影响取CM-U加入正常培养的SY5Y细胞中孵育72h，收集细胞培养上清。通过放免法检测细胞外Aβ的总量，各转染组之间无显著性差异(P＞0.05)。
结论1.EGFP是很好的报告基因，通过构建EGFP和PS1基因共表达质粒，使EGFP能够定性、定量的报告PS1基因的表达情况。本研究通过荧光显微镜观察EGFP和Westernblot分析PS1蛋白，证实PS1基因转染SY5Y细胞成功。wt和mt基因转染组可见到明显的PS1蛋白表达，而mock转染组和未转染组SY5Y细胞仅有微量的PS1蛋白表达。
2.在本文所构建的SY5Y与U251细胞相互作用体系中，PS1基因突变(Val97Leu/Ala136Gly)可降低SY5Y细胞的凋亡易感性，可能与反应过程中U251细胞产生的IL-1β减少有关。
3.Val97Leu和Ala136Gly两种PS1基因突变可能不是导致FAD发病的单一独立因素，神经胶质细胞的存在及其引起的炎症反应对神经元的功能和活动起到重要的调节作用。