【目的】 诱导经基因修饰的人骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)向软骨细胞稳定分化的相关问题探讨： 1．分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞(BMSCs)。 2．克隆人Chondromodulin-Ⅰ cDNA。 3．提取SOX5、SOX6和SOX9(SOX-5/6/9)基因的质粒，并包装至慢病毒(lentivirus)载体。 【方法】 1．分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞的实验：从复旦大学附属中山医院骨科接受脊柱或骨盆手术的20-40岁患者(男女不限)废弃的胸椎、腰椎椎体或髂骨中抽取3-5 ml骨髓，经密度梯度离心法分离出单个核细胞，通过黏附贴壁筛选及传代扩增，经流式细胞仪鉴定细胞表面相对特异性分子阳性率满意后，用作基因转染的目的细胞。 2．克隆人Chondromodulin-Ⅰ cDNA的实验：利用复旦大学附属耳鼻喉科医院20-40岁接受鼻中隔切除手术的患者(男女不限)废弃的鼻中隔软骨分离软骨细胞，原代培养后提取软骨RNA，通过RT-PCR等方法完成Chondromodulin-Ⅰ cDNA克隆，结果送DNA测序。 3．提取SOX-5/6/9基因的质粒，并包装至慢病毒载体的实验：将由日本东京大学馈赠的少量SOX-5/6/9质粒，电转至感受态细菌，随细菌繁殖扩增质粒，之后通过质粒大抽将其提取出来，DNA测序鉴定正确后包装至慢病毒载体，以待转染。 【结果】 1．分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞的实验：经密度梯度离心法分离的人骨髓单个核细胞扩增至第5代时，通过流式细胞仪检测细胞表面相对特异性分子阳性表达率，CD105为97％，CD166为94.8％，CD29为98.5％。与文献中报导的P2代人BMSCs细胞表面标志检测结果(CD105为78％±6％，CD166为43％±7％，CD29为69％±12％)比较，以上3个分子阳性率均有显著提高。 2．克隆人Chondromodulin-Ⅰ cDNA的实验：经DNA测序鉴定，Chondromodulin-Ⅰ cDNA序列完全正确。 3．提取SOX-5/6*/9基因的质粒，并包装至慢病毒载体的实验：SOX-5/6/9基因质粒顺利提取，已成功包装至慢病毒(lentivirus)载体。 【结论】 1．分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞的实验：经适当培养方法可以获取相当纯度的人BMSCs。 2．克隆人Chondromodulin-Ⅰ cDNA的实验：从人软骨细胞的培养至目的基因测序正确，标志着人Chondromodulin-Ⅰ cDNA的成功克隆。 3．提取SON-5/6/9基因的质粒，并包装至慢病毒载体的实验： SOX-5/6/9基因可被包装至慢病毒载体。