论文部分内容阅读
肿瘤转移是乳腺癌病人死亡的主要原因。目前认为肿瘤的发生发展是肿瘤细胞和其生长微环境信息交换进化的结果。脂肪细胞大量存在于乳腺癌微环境中,乳腺癌周边的脂肪细胞能够被乳腺癌细胞激活并转化为“肿瘤相关脂肪细胞(cancer-associated adipocytes,CAAs)”,参与微环境重塑并促进乳腺癌发展,但其具体机制目前还不清楚。我们通过建立脂肪细胞与乳腺癌细胞共培养体外功能研究体系,发现与乳腺癌细胞共培养后,脂肪细胞能转变为CAAs,并促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。为进一步探索脂肪细胞促进乳腺癌转移的分子机制,我们利用转录组测序(RNA-Seq)鉴定了在脂肪细胞和CAAs中差异表达的细胞因子,发现G-CSF在CAAs中显著高表达。Q-PCR实验证实,CAAs中G-CSF表达明显上调,ELISA结果显示CAA上清(CAA-CM)中G-CSF蛋白含量明显增多。功能研究发现,CAAs来源的G-CSF通过促进乳腺癌细胞Stat3信号活化,诱导EMT,促进乳腺癌细胞的迁移与侵袭;利用抗G-CSF中和性抗体或Stat3抑制剂Stattic可以抑制CAA-CM或G-CSF诱导的乳腺癌细胞EMT、迁移和侵袭;通过Q-PCR检测发现,与正常脂肪组织相比,临床乳腺癌癌旁脂肪组织中G-CSF的表达明显升高。因此通过本研究我们阐明,脂肪细胞与乳腺癌细胞相互作用后,引起脂肪源性细胞因子G-CSF分泌增多,激活乳腺癌细胞Stat3信号通路,促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。方法:1.原代培养人乳腺前脂肪细胞,利用免疫荧光及流式细胞技术鉴定其纯度;利用成脂诱导分化培养基,诱导前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,通过Q-PCR方法检测其分化标志物,油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。2.利用共培养小室建立脂肪细胞与乳腺癌细胞共培养体外模型。共培养36h后,撤去共培养小室,脂肪细胞换成无血清的DMEM,继续培养24h后,收集对照组脂肪上清(Adi-CM)、共培养后的脂肪上清(CAA-CM)。用脂肪上清作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过细胞划痕、transwell迁移、侵袭实验和MTT分别检测CAA-CM对乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响。3.以单独培养的脂肪细胞为对照组(Con.),分别以乳腺癌MDA-MB-231细胞上清培养脂肪细胞(CM),和脂肪细胞与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养(Co-culture)为实验组,24h后,提取脂肪细胞总RNA,通过RNA-Seq筛选脂肪细胞差异表达的分泌蛋白基因。利用Q-PCR实验,验证共培养后脂肪细胞差异表达的基因;并通过ELISA检测共培养后脂肪细胞上清中G-CSF的含量。4.用Adi-CM、CAA-CM和/或抗G-CSF中和性抗体(α-G-CSF)处理乳腺癌细胞株,用含0.2%血清的DMEM作为阴性对照。通过细胞划痕、transwell迁移和侵袭实验分别检测α-G-CSF对CAA-CM诱导的乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响。通过Western blot检测α-G-CSF对CAA-CM诱导的乳腺癌细胞Stat3-Y705磷酸化的影响。5.利用人重组G-CSF(rh G-CSF)蛋白处理乳腺癌细胞株或构建G-CSF过表达的MDA-MD-231稳定细胞株,通过细胞划痕、transwell迁移和侵袭实验分别检测G-CSF对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响;通过Western blot检测G-CSF对乳腺癌细胞Stat3通路的影响。使用α-G-CSF或Stat3抑制剂Stattic处理乳腺癌细胞,通过细胞划痕、transwell迁移和基质胶侵袭实验分别检测其对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响;通过Western blot检测其对乳腺癌细胞Stat3-Y705磷酸化的影响。6.通过Q-PCR和Western blot方法检测rh G-CSF和Stattic处理后乳腺癌细胞中EMT标志物的改变;通过鬼笔环肽染色,检测G-CSF对乳腺癌细胞形态和细胞骨架的影响。7.通过Q-PCR方法检测rh G-CSF、CAA-CM和/或α-G-CSF、Stattic处理的乳腺癌细胞株中促癌基因MMP2、MMP9的表达;同时,检测G-CSF过表达的MDA-MD-231稳定细胞株中促癌基因MMP2、MMP9的表达。8.利用苏木精-伊红(HE)染色,检测临床乳腺癌组织样本中乳腺癌组织与脂肪组织交界处的脂肪细胞的形态改变情况;利用Q-PCR的方法检测临床乳腺癌癌旁脂肪细胞中及CAA-CM处理后乳腺癌细胞中G-CSF的表达。结果:1.通过免疫荧光鉴定原代培养的前脂肪细胞,发现细胞表面标志物CD45表达呈阴性,S100表达呈阳性;流式细胞仪鉴定发现,前脂肪细胞表面间充质细胞标志物CD44、CD90表达阳性,其纯度大于90%。用成脂诱导培养基诱导至15-16天,脂肪细胞分化率达到50-60%,油红O染色阳性。通过Q-PCR检测发现,成熟脂肪细胞中脂肪细胞分化标志物PPAR-γ、C/EBP-α、FABP4明显升高,HSL、PREF1明显降低。2.通过Q-PCR检测发现,共培养后脂肪细胞中的分化标志物PPAR-γ、C/EBP-α明显降低,HSL及促炎因子IL-6、IL-1β表达上调。通过细胞划痕和transwell迁移实验发现,CAA-CM能显著促进乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞迁移能力;transwell基质胶侵袭实验发现,CAA-CM能明显促进乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549侵袭能力。MTT检测发现,CAA-CM对乳腺癌细胞的增殖无明显影响。3.通过RNA-Seq,筛选出CM组与Co-cuture组共同差异表达基因195个,其中差异表达分泌蛋白基因有30个。通过Q-PCR实验,验证共培养后脂肪细胞差异表达的基因,发现G-CSF为表达上调较为显著的基因;通过ELISA检测发现,共培养后脂肪细胞上清中G-CSF的含量明显增多。4.细胞划痕实验和transwell实验发现,CAA-CM能够明显促进乳腺癌细胞迁移和侵袭;Western blot检测发现CAA-CM明显促进乳腺癌细胞Stat3-Y705的磷酸化。使用α-G-CSF特异性抑制脂肪源性G-CSF的作用,发现α-G-CSF能明显抑制CAA-CM诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力,并明显抑制Stat3-Y705的磷酸化。5.细胞划痕实验和transwell迁移实验发现,rh G-CSF明显促进乳腺癌细胞的迁移能力;侵袭实验发现,rh G-CSF明显促进乳腺癌细胞的侵袭能力。Western blot检测发现rh G-CSF明显促进乳腺癌细胞Stat3-Y705的磷酸化。使用α-G-CSF或用Stattic处理乳腺癌细胞,发现α-G-CSF和Stattic能明显抑制CAA-CM和G-CSF诱导的乳腺癌细胞迁移和侵袭能力,并明显抑制Stat3-Y705的磷酸化。6.通过Western blot和Q-PCR,发现G-CSF促进EMT标志物基因(N-cadherin、vimentin、fibronectin、α-SMA)的表达,而Stattic明显抑制这些EMT标志物基因的表达。通过鬼笔环肽染色发现,用rh G-CSF处理后的MDA-MD-231细胞形态更细长,且细胞伪足明显增加。7.通过Q-PCR,发现CAA-CM、rh G-CSF处理后,乳腺癌细胞中MMP2、MMP9的表达明显增加;而α-G-CSF或Stattic处理后明显抑制该过程。8.通过HE染色,发现乳腺癌旁脂肪细胞的体积明显变小;通过Q-PCR检测发现,癌旁脂肪组织及CAA-CM处理后乳腺癌细胞中G-CSF、IL-6、IL-1β表达明显增加。结论:1.与乳腺癌细胞共培养后,脂肪细胞转变为CAAs,并明显促进乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞的迁移和侵袭能力。2.通过RNA-Seq筛选出CAAs差异表达分泌蛋白基因G-CSF。3.脂肪源性G-CSF通过激活乳腺癌细胞Stat3的活性,诱导乳腺癌细胞EMT,从而促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。4.人乳腺癌癌旁脂肪细胞中G-CSF的表达增高。