【摘 要】
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砷(As)是一种有毒物质,对人类身体健康与环境造成威胁,因此需要快速简便的方法来敏感和专一性地检测饮用水中的砷浓度。在此背景下,本课题基于砷离子结合蛋白Ars R及其特异性启动子Pars,设计多重模块组装的砷离子生物传感器的基因电路,并通过耦联正反馈电路调控模块对生物传感器的检测限、灵敏度以及特异性等性能进行优化。设计8种含有不同荧光报告基因元件以及不同模块组合的基因电路,并构建相应底盘细胞。根据
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砷(As)是一种有毒物质,对人类身体健康与环境造成威胁,因此需要快速简便的方法来敏感和专一性地检测饮用水中的砷浓度。在此背景下,本课题基于砷离子结合蛋白Ars R及其特异性启动子Pars,设计多重模块组装的砷离子生物传感器的基因电路,并通过耦联正反馈电路调控模块对生物传感器的检测限、灵敏度以及特异性等性能进行优化。设计8种含有不同荧光报告基因元件以及不同模块组合的基因电路,并构建相应底盘细胞。根据荧光检测结果发现,只有以红色荧光基因mcherry作为报告元件的生物传感器AM与以绿色荧光基因egfp作为报告元件的生物传感器AE表达的荧光信号与砷离子浓度具有梯度关系,且AM比AE的背景值低,灵敏度高,因此选择红色荧光基因mcherry作为报告元件。基于构建的AM基因电路耦联正反馈放大系统获得砷离子生物传感器AL底盘细胞。当使用半饱和亚砷酸盐As(III)浓度作为灵敏度特征值评估时,具有正反馈系统的AL的灵敏度比没有正反馈系统的AM高20倍,且最低检测限降低了5倍,达到0.1μM,低于世界卫生组织的饮用水中砷含量标准。由于输出信号的放大,AL能够在更短的时间内提供可检测的信号,将达到同等荧光信号强度的底盘细胞培养时间缩短3~4个小时。特异性实验表明,AL在最低检测限处对As(III)仍表现出良好的特异性,正反馈电路的耦联将生物传感器可特异性检测的离子浓度降低了10倍且特异性信号比值提高了1.5~7.5倍。此外,在As(III)和Cd(II)共存时,正反馈生物传感器AL与镉离子生物传感器CM组成的混菌检测体系可以实现对0.1~100μM的As(III)和1~100μM的Cd(II)检测。总的来说,设计的正反馈生物传感器满足As(III)检测的要求,具有高灵敏度、高特异性以及良好的应用价值。这项工作还证明了遗传电路工程在设计生物传感器中的重要性,并且在开发全细胞生物传感器以检测其他诱导物时应考虑正反馈放大器。
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