β-D-半乳糖苷酶（β-D-galactoside galactohydrolase,EC 3.2.2.23）又称乳糖酶（Lactase）,能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷转移的作用。乳糖酶主要用于治疗乳糖不耐受症、生产低乳糖乳制品和低聚半乳糖。乳糖酶在免疫、检测及疾病诊断等方面也具有十分重要的意义。本论文利用大肠杆菌原核表达系统表达了乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因Lac4,并对重组乳糖酶的酶学性质进行分析,对基因工程菌的诱导表达条件进行优化,为乳糖酶的工业化生产和开发多功能的乳糖酶产品奠定基础。本研究得到的结论如下:1.乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达。将重组表达质粒pET-28a-lac4转化大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导乳糖酶表达,超声波破碎后进行SDS-PAGE分析,乳糖酶基因在大肠杆菌中获得活性表达,重组乳糖酶以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,而且两种形式的蛋白含量几乎相同。利用Ni-NTA亲和层析技术对重组乳糖酶进行纯化,Bradford Assay分析方法测定蛋白浓度,纯化的乳糖酶浓度为80.56μg/ml,乳糖酶活性为20.59±0.19 U/ml,比酶活性为255.55±2.32 U/mg。2.乳糖酶的酶学性质分析。对乳糖酶原酶液进行Ni-NTA亲和层析纯化,在SDS-PAGE上呈现出单一的蛋白带,重组乳糖酶酶分子量约为122 kDa。该酶最适反应pH为7.0,属中性酶,在pH4.0-10.0范围内有良好的稳定性;最适反应温度为43℃,37℃时乳糖酶的热稳定性较好,半衰期为30min;Ca²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺对酶有非常明显的激活作用,Cu²⁺对酶具有很强的抑制作用,表明该乳糖酶有一定的金属离子依赖性;在43℃,pH7.0条件下,以不同浓度的ONPG为底物,采用双倒数作图法,测定其Km值为3.49 mmol/L,Vmax值为4.22 mmol/min.mg。3.乳糖酶基因工程菌发酵条件的优化。采用正交设计试验对工程菌的培养基配方及诱导表达条件进行优化。确定最佳发酵培养基配方为:酵母粉3.0%,蛋白胨2.5%,葡萄糖2.5%,NaCl 1.0%;最佳培养及诱导条件为:诱导温度28℃,装液量10%,接种量1%,IPTG浓度0.15 mmol/L,诱导4.5 h。在此条件下对乳糖酶工程菌进行诱导培养,产酶水平可达到116.69 U/ml。