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口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由小RNA病毒科口疮病毒属的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染的重大动物疫病。主要感染偶蹄兽。FMDV分为A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型,每个血清型又有若干亚型。该病危害极其严重,给养殖业造成巨额的经济损失。本研究通过比对分析FMDV结构蛋白P1和非蛋白3A基因的核苷酸序列差异,研究FMDV的遗传变异趋势,为疫苗毒株筛选和阐明病毒感染机制打下基础。同时,通过应用均匀设计法优化反应参数,建立一种快速、准确的口蹄疫病毒检测方法。(1)本研究对收获的牛、乳鼠、猪动物宿主及BHK-21细胞的O型口蹄疫病毒株,提取RNA,通过RT-PCR,回收产物,并将P1的1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)以及3A基因分别其克隆到pMD19-T载体上,筛选阳性菌落并培养,测序分析。结果表明:转化后获得的白色菌落,经挑取单菌落培养后,挑取1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)和3A基因的阳性转化菌落培养液进行PCR扩增,经电泳检测,牛、猪、乳鼠及BHK-21细胞适应毒株的菌液均获得与预期条带大小为399 bp、683 bp、780 bp、672 bp、543 bp左右的片段,证明不同适应毒的1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)和3A基因已插入pMD19-T载体。牛、乳鼠、猪动物和BHK-21细胞适应毒株间,P1基因核苷酸序列相似性在99.6%~99.8%,氨基酸序列相似性在99.3%~99.9%,其核苷酸和氨基酸序列未发生缺失,主要抗原位点稳定;P1基因发生了部分变异,变异程度依次为VP1、VP2>VP3>VP4,VP4基因最为保守;3A基因核苷酸序列相似性在99.6%~100%,氨基酸序列相似性在99.3%~100%,核苷酸相似性很高,均未出现碱基缺失。3A基因较稳定,变异较少;不同宿主适应毒株在基因水平上变异程度依次为:猪适应毒株>BHK-21细胞适应毒株>牛适应毒株>鼠适应毒株。O型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异,但主要抗原位点稳定;VP2基因的变异均位于抗原表位上;基于鼠适应毒株基因变异最小,用其作为口蹄疫原始毒株的保存更为有利。(2)通过在O型口蹄疫病毒的P1基因的保守区,设计出1对特异性引物,应用均匀设计法优化反应参数,研究建立了口蹄疫O型病毒二温式RT-PCR检测方法;并对该法进行了特异性和敏感性试验检测。结果表明,该二温式PCR方法只对O型口蹄疫病毒敏感,对其他血清型的口蹄疫病毒及常见的猪病病毒不敏感;扩增条带与预期目的片段大小(339 bp)的特异性条带相符,扩增片段经克隆、测序发现与引物所在基因序列的同源性为100%;检测病毒RNA的敏感性为1.665 pg/μL,其敏感性与三步法PCR敏感性检测结果没有差异。运用该法对54头攻毒试验的动物进行检测,阳性鉴定结果与三步法PCR鉴定结果一致。与三步法PCR相比该法节省了20 min,表明所建立的O型口蹄疫病毒二温式RT-PCR方法是一种准确、快速、特异、敏感的检测方法。