背景与目的:　　脑缺血性疾病严重威胁人类的健康和生命，炎症反应在脑缺血损伤发生发展的各个阶段均起关键作用。目前针对神经炎症的治疗策略主要是抑制炎症启动与发生，虽可延缓炎症的发展，但也削弱了炎症的保护作用，甚至使炎症慢性化、导致慢性神经退行性疾病。消退素（resolvins, Rvs）来自ω-3不饱和脂肪酸，是一类有抗炎和促炎症消退作用的脂质介质。现已证实当肝脏、肺脏和肾脏等组织器官出现缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion，I/R）时，应用消退素D1（resolvin D1, RvD1）能减轻损伤的程度，具有保护作用。但RvD1对缺血再灌注引起的脑组织损伤是否有神经保护作用，目前国内、国外尚未报道。本研究拟采用大鼠短时性局灶性脑缺血再灌注模型和LPS刺激体外培养的BV-2小胶质细胞炎症模型，检测 RvD1对缺血再灌注后炎症反应的影响，为进一步探索RvD1防治脑血管疾病提供实验依据。　　材料与方法:　　1.动物选择及分组　　选择清洁级健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，随机分为假手术组（Sham组）和处理组，处理组大鼠于脑缺血再灌注开始即刻（5min内）经侧脑室注射5μl生理盐水溶液、不同剂量RvD1(0.03、0.1或0.3 nmol)5μl或10nmolRvD1受体阻断剂（butyloxycarbonyl-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe，Boc-2）。Boc-2在大鼠注射RvD1前30 min注射。Sham组经侧脑室注射5μl生理盐水溶液。　　2.运用改良线栓法阻断大鼠大脑中动脉供血2h后实施再灌注制备大鼠短时性局灶性脑缺血再灌注模型（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）。　　3.根据Longa评分标准评价实验大鼠脑缺血再灌注6 h、12h、24 h神经功能缺损评分。　　4.大鼠脑缺血再灌注12h、24 h脑梗死体积的变化运用氯化三苯四氮唑(2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色法进行检测。　　5.大鼠脑缺血再灌注24 h脑组织的含水量用干湿比法进行测定。　　6．用苏木素染色（Hematoxylin and eosin，HE）后在普通光镜下观察大鼠脑缺血再灌注24 h时脑组织的病理变化。　　7．用免疫荧光标记大鼠脑缺血再灌注24 h时大鼠脑组织OX-42蛋白表达，观察小胶质细胞激活情况。　　8．用MPO试剂盒检测大鼠脑缺血再灌注后6h、12h、24h MPO活性，评估中性粒细胞浸润情况。　　9．用ELISA法检测大鼠脑缺血再灌注24 h时脑组织中白介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)水平。　　10．EMSA检测大鼠脑缺血再灌注24 h时脑组织中NF-κB的DNA结合活性。　　11．用Western blot检测大鼠脑缺血再灌注24h时基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白表达；用明胶酶谱法检测MMP-9活性。　　12．细胞培养及实验分组　　将脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(终浓度为100ng/ml)加入BV-2小胶质细胞培养液中，孵育24h制作炎症模型。实验分为5组：control组、RvD1组、LPS组、RvD1+LPS组和Boc-2+ RvD1+LPS组。用ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。　　13.统计学分析　　采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差( x?s)表示。符合正态分布者多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差（LSD）检验。不符合正态分布者采用秩和检验。检验水准为α=0.05。　　结果:　　1. RvD1对大鼠神经功能评分的影响　　在再灌注24 h，评价Sham组、vehicle组和不同剂量RvD1(0.03,0.1和0.3 nmol)组大鼠神经功能缺损评分，结果显示：在再灌注24 h，与vehicle组比较， RvD1(0.1)组和RvD1(0.3)组神经功能评分显著降低（P<0.01）。在再灌注6h、12h、24 h，评价Sham组、vehicle组和RvD1(0.1)组大鼠进行神经功能评分，结果显示：在再灌注12h和24 h，与vehicle组比较， RvD1(0.1)组神经功能评分显著降低（P<0.05或P<0.01）。　　2.RvD1对大鼠脑组织病理学的影响　　HE染色显示脑组织损伤的程度。Sham组未见明显的神经细胞损伤；与Sham组比较，vehicle组神经细胞核固缩现象明显增加，提示细胞核损伤加重，同时，发现明显的间质水肿，空泡形成。RvD1(0.1)组核固缩、空泡形成和间质水肿现象明显减轻。　　3.RvD1对大鼠脑梗死体积的影响　　在再灌注24 h，检测Sham组、vehicle组和不同剂量RvD1(0.03,0.1和0.3 nmol)组大鼠脑梗死体积，结果显示：在再灌注24 h，与vehicle组比较，RvD1(0.1)组和RvD1(0.3)组脑梗死体积显著减小（P<0.01），而RvD1(0.03)组脑梗死体积无明显变化。在再灌注12h、24 h，检测Sham组、vehicle组和RvD1(0.1)组大鼠脑梗死体积，结果显示：在再灌注12h、24 h，与vehicle组比较，RvD1(0.1)组脑梗死体积明显减小（P<0.01）。　　4．RvD1对大鼠脑组织含水量的影响　　在再灌注24h，检测Sham组、vehicle组和不同剂量RvD1(0.03,0.1和0.3 nmol)组大鼠脑组织含水量，结果显示：与Sham组比较，vehicle组大鼠脑含水量明显增加（P<0.01）；与vehicle组比较， RvD1(0.1)组和RvD1(0.3)组脑组织含水量明显减少（P<0.05）。　　5．RvD1对小胶质细胞激活的影响　　荧光显微镜下观察免疫组化染色的脑组织切片，OX-42蛋白可作为小胶质细胞标记物。激活的小胶质细胞胞体增大，形态改变，可见阿米巴样小胶质细胞。比较各组小胶质细胞激活情况：与Sham组比较， vehicle组、RvD1(0.1)组和Boc-2+RvD1(0.1)组OX-42染色阳性的激活小胶质细胞数量明显增加（P<0.05）；与vehicle组比较，RvD1(0.1)组OX-42染色阳性的激活小胶质细胞数量明显减少（P<0.05）。　　6．RvD1对MPO活性的影响　　测定脑缺血再灌注后6h、12h、24h MPO活性，评估RvD1对MPO活性的影响， MPO活性反映中性粒细胞在组织中的浸润情况。在脑缺血再灌注后12h，与sham组比较，vehicle处理组MPO活性明显增强（P<0.05）；与vehicle处理组比较， RvD1组MPO活性明显降低（P<0.05）。在脑缺血再灌注后24h，与sham组比较， vehicle处理组MPO活性明显增强（P<0.01）；与vehicle处理组比较，RvD1组MPO活性明显降低（P<0.01）；与RvD1比较，Boc-2+RvD1组MPO活性明显增强（P<0.01）　　7．RvD1对脑组织中炎症因子水平的影响　　分别于脑缺血再灌注后6h、12h、24h测定脑组织中促炎症细胞因子IL-1β水平。结果显示：在脑缺血再灌注后6h，与sham组比较，vehicle组IL-1β水平明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较，RvD1组IL-1β水平明显降低（P<0.01）；与RvD1比较，Boc-2+RvD1组IL-1β水平明显升高（P<0.01）。在脑缺血再灌注后12h，与sham组比较，vehicle组IL-1β水平明显升高（P<0.01）。在脑缺血再灌注后最初6 hIL-1β水平明显升高，之后逐渐降低，在脑缺血再灌注后24h接近sham组水平。　　分别于脑缺血再灌注后6h、12h、24h测定脑组织中促炎症细胞因子TNF-α水平，结果显示：在脑缺血再灌注后6h，与sham组比较，vehicle组TNF-α水平明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较，RvD1组TNF-α水平明显降低（P<0.01）；与RvD1比较，Boc-2+RvD1组TNF-α水平明显升高（P<0.05）。在脑缺血再灌注后12h，与sham组比较，vehicle组TNF-α水平明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较，RvD1组TNF-α水平明显降低（P<0.05）。在脑缺血再灌注后24h，与sham组比较，vehicle组TNF-α水平明显升高（P<0.05）。在脑缺血再灌注后最初6 h TNF-α水平明显升高，之后逐渐降低。　　分别于脑缺血再灌注后6h、12h、24h测定脑组织中促炎症细胞因子IL-6水平，结果显示：在脑缺血再灌注后12h，与sham组比较，vehicle组IL-6水平明显升高（P<0.05）。在脑缺血再灌注后24h，与sham组比较，vehicle组IL-6水平明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较，RvD1组IL-6水平明显降低（P<0.05）；与RvD1比较，Boc-2+RvD1组IL-6水平明显升高（P<0.05）。　　8. RvD1对脑组织中NF-κΒ活性的影响　　EMSA检测大鼠脑缺血再灌注24 h时脑组织中NF-κB的DNA结合活性。结果显示：与Sham组比较，vehicle组脑组织中NF-κB的DNA结合活性明显增强；与vehicle组比较，RvD1组脑组织中NF-κB的DNA结合活性明显降低；与RvD1比较， Boc-2+RvD1组脑组织中NF-κB的DNA结合活性明显增强。　　9．RvD1对脑组织中MMP-9蛋白表达及MMP-9活性的影响　　Western blot法检测大鼠脑缺血再灌注24 h时MMP-9蛋白表达；明胶酶谱法检测MMP-9活性。结果显示：与Sham组比较，vehicle组MMP-9活性明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较，RvD1组 MMP-9活性明显降低（P<0.05）。与Sham组比较，vehicle组MMP-9蛋白表达明显升高（P<0.01）；与vehicle组比较， RvD1组MMP-9蛋白表达明显降低（P<0.01）。　　10．RvD1对LPS诱导BV-2细胞上清液中炎症因子水平的影响　　100ng/ml LPS刺激BV-2细胞24h后，与control组比较，LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著增加(P<0.01)；与LPS组比较，10nM RvD1+LPS组和100nM RvD1+LPS组IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著减小(P<0.01)。与100nM RvD1+LPS组比较，Boc-2+RvD1+LPS组IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著增加(P<0.01)。　　结论:　　1．本研究中采用线栓法制作大鼠tMCAO模型稳定性好，可信度高；适当剂量的RvD1显著降低大鼠脑缺血再灌注后的神经功能评分、改善脑组织的病理学改变，降低脑梗死体积和脑组织含水量。　　2.消退素D1可能通过抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞的激活、降低髓过氧化物酶的活性、抑制炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，抑制MMP-9的蛋白表达和活性，起到神经保护作用，其机制可能与抑制NF-κB DNA结合活性有关。　　3. RvD1可抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。