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背景丙烯醛(Acrolein,Acr)是一种广泛存在的空气污染物,其易挥发性使其更易经肺进入机体。肺损伤是丙烯醛对机体造成的重要危害之一,其机制可能是引起氧化应激,导致细胞氧化还原紊乱,进一步造成细胞活性降低或死亡。节律基因Per 1(Period 1,Per1)和转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)对于多种细胞的增殖以及组织损伤后的修复具有重要的调控作用。本课题拟通过研究丙烯醛对肺上皮细胞增殖活力的影响,及其对Per1基因表达的影响,探讨丙烯醛造成肺上皮的损伤及其修复机制,为研究丙烯醛暴露引起呼吸道疾病及其治疗提供依据。目的研究丙烯醛对肺上皮细胞增殖活力的影响,同时探讨丙烯醛对节律蛋白Per1表达的影响。探索TGF-β对丙烯醛刺激后肺上皮细胞增殖和Per 1蛋白的表达的调节作用。方法选用A549和MLE15两种肺上皮细胞株作为研究模型,在细胞汇合度达到80%时,分别用含或不含丙烯醛(80μMol/L)的磷酸盐缓冲液PBS(Phosphate Buffered Saline)处理细胞30分钟,分别记为A549-Acr组,A549-PBS组,MLE15-Acr组和MLE15-PBS组,弃去处理液后继续培养24小时。用CCK-8试剂盒检测细胞增殖(每隔12小时),同时用EdU细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖情况。然后用Western blot方法检测肺上皮细胞中Per 1蛋白的表达水平(处理后24小时)。然后,为了探索TGF-β干预是否能够改善丙烯醛引起的肺上皮细胞损伤,仍然选用A549和MLE15两种肺上皮细胞株作为研究模型,在细胞汇合度达到80%时用含或不含80μMol/L丙烯醛的PBS处理细胞30分钟后,再继续用添加或不添加TGF-β(10 mg/L)的培养液继续培养,从而建立丙烯醛和TGF-β共处理肺上皮细胞模型,分别记为A549-Acr-TGF-β组,A549-PBS-TGF-β组,A549-AcrPBS组,A549-PBS-PBS组,MLE15-Acr-TGF-β组,MLE15-PBS-TGF-β组,MLE15-Acr-PBS组和MLE15-PBS-PBS组。用上述同样的方法检测增殖指标及Per 1蛋白的表达情况。用SPSS20.0软件对实验数据进行统计学分析,两组样本之间比较采用T检验,多组之间比较采用方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1.光镜下观察发现,在A549细胞中,与A549-PBS组相比,丙烯醛处理后A549-Acr组细胞漂浮较多,汇合度降低,细胞形态发生改变;在MLE15细胞中,与MLE15-PBS组相比,丙烯醛处理后MLE15-Acr组漂浮明显,汇合度降低。2.在肺上皮细胞中,与PBS对照组相比,在处理后相同时间,在A549细胞中,丙烯醛处理组CCK-8实验吸光度值比PBS对照组的吸光度值低,差异有统计学意义(F=211.782,P<0.001),在MLE15细胞中,丙烯醛处理组CCK-8实验吸光度值明显低于PBS对照组,差异有统计学意义(F=22.495,P=0.003),说明不同处理组细胞的增殖情况不同;同种细胞同种处理方式在不同时间点吸光度也存在不同,表示同种细胞同种处理方式在不同时间点增殖情况也不同。丙烯醛处理后24小时,通过EdU法检测细胞增殖情况,在A549细胞中,A549-Acr组细胞增殖比率有明显降低(T=7.625,P<0.001),在MLE15细胞中,MLE15-Acr组细胞增殖比率与MLE15-PBS组相比,明显降低(T=20.757,P<0.001)。丙烯醛处理后24小时,A549-Acr组Per 1蛋白表达量较A549-PBS组降低(T=4.26,P=0.013),MLE-Acr组Per 1蛋白表达量较MLE15-PBS组降低(T=8.347,P=0.001)。3.在用丙烯醛处理结束以后,细胞恢复培养过程中添加TGF-β后,在A549细胞和MLE15细胞中,Acr-TGF-β组CCK-8实验吸光度值和PBS-TGF-β组相比较低,差异有统计学意义(P<0.001);Acr-TGF-β组CCK-8实验吸光度值和PBS-PBS组相比有所下降,差异有统计学意义(P<0.001);Acr-PBS组CCK-8实验吸光度值和PBS-TGF-β组相比较低,差异有统计学意义(P<0.001);Acr-PBS组CCK-8实验吸光度值和PBS-PBS组相比较低,差异有统计学意义(P<0.001),同种细胞同种处理方式在不同时间点CCK-8实验吸光度也存在不同。EdU法检测发现A549-Acr-TGF-β组和A549-Acr-PBS组相比,A549-Acr-TGF-β组EdU阳性细胞比率更大,差异有统计学意义(P=0.001);但在MLE15细胞中丙烯醛处理后添加TGF-β并未使细胞EdU阳性细胞比率上升。A549-Acr-TGF-β组较A549-Acr-PBS组Per 1蛋白表达量上升(P<0.05),MLE15-Acr-TGF-β组较MLE15-Acr-PBS组Per1蛋白表达量上升(P<0.05)。结论1.丙烯醛处理能够引起肺上皮细胞增殖能力下降甚至丧失,同时能够下调节律蛋白Per 1的表达水平。2.用丙烯醛处理结束以后,细胞恢复培养过程中添加TGF-β并未明显改善丙烯醛导致的细胞增殖能力的降低,但是显著提高了Per 1蛋白的表达水平。