论文部分内容阅读
血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。血吸虫不同发育阶段虫体呈现出不同的基因差异表达模式,整个生活史显现出明显的生物学和形态学变化,复杂多样且具有多种免疫逃避机制。由Wnt蛋白与七次跨膜结构域的表面受体家族frizzled蛋白及一系列上下游信号分子构成的复杂的Wnt信号通路,参与了从动物胚胎到成体的一系列控制胚胎早期的发育、细胞极性决定、细胞分化、细胞增殖及生长发育的调控。异常表达或激活该途径会导致各种疾病甚至肿瘤发生。Wnt通过它的七次跨膜受体蛋白Frizzled激活β-catenin影响靶基因的表达。本研究是在获得日本血吸虫信号转导蛋白Wnt4和Wnt10a的基础上,首次克隆了日本血吸虫两个编码Wnt受体蛋白Frizzled的基因,并对其进行了生物学功能研究。
通过NCBI网站Genbank数据库搜寻到两个与Wnt受体蛋白相关的日本血吸虫EST片段(GenBank登录号AY808353、AY810296)。据此EST序列,利用RACE技术首次从日本血吸虫7d肝期童虫和42d成虫组织中获得日本血吸虫Wnt受体蛋白sjFz5(GenBank登录号EU370926)编码基因和sjFz7(GenBank登录号EU370927)编码基因。sjFz5编码基因的开放阅读框ORF为2604bp,编码867个氨基酸,等电点8.14,理论分子量为98.264kD,酸性氨基酸残基总数为58个,碱性氨基酸残基总数为67个;sjFz7编码基因的ORF为2097bp,编码698个氨基酸,等电点8.15,理论分子量为77.506kD,酸性氨基酸残基总数为53个,碱性氨基酸残基总数为62个。信号肽预测分析sjFz5含有一个23个氨基酸的信号肽,sjFz7含有一个20个氨基酸的信号肽,都属于分泌型蛋白;跨膜区结构预测,发现sjFz5和sjFz7都具有典型的七次跨膜特征;疏水性和抗原肽分析显示它们疏水性区域分布比较均匀,靠近N端都有较好的疏水性,sjFz5和SjFz7蛋白都具有多个抗原位点,显示有良好的免疫原性。一系列生物信息学分析表明这两个基因编码的蛋白质具有十分典型的Wnt受体家族蛋白特征。
运用荧光实时定量RT-PCR技术分析sjFz5和sjFz7基因在血吸虫不同发育时期的表达情况,图表显示它们都在18d童虫中高表达,推测这两条基因在日本血吸虫童虫发育中起重要的调控作用,在从童虫到成虫生长过渡中是重要的生长发育信号调节因子。sjFz5基因在42d雌虫中没有检测到,说明该基因在不同性别中还存在着差异表达,可能对日本血吸虫雄性虫体的发育及维持雄性虫体性状具有重要意义。
本实验成功构建了编码日本血吸虫Wnt受体蛋白基因sjFz5和sjFz7胞外结构域CRD(含10个保守半胱氨酸)区域真核表达载体pRK5-Fz1CRD-Fz5和pRK5-Fz1CRD-Fz7,这为深入研究sjFz5和sjFz7受体真核表达情况以及其在Wnt/β-catenin传导途径中的作用奠定了基础,也为了进一步探索哺乳动物细胞膜上Wnt蛋白质之间的相互作用提供了新的研究方向。
本论文首次探索对日本血吸虫Wnt信号受体蛋白的研究,也是首次获得了两个编码Wnt受体蛋白的基因,为深入研究Wnt信号通路在日本血吸虫生长发育中的作用,进一步了解血吸虫生长发育机理,寻找发育调控中的关键的信号分子基因组中适合高通量药物筛选靶点的功能未知基因,设计新型药物奠定了良好的基础。