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EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是第一个被发现与人类肿瘤相关的病毒。目前已明确与鼻咽癌(NPC)、何杰金氏(HD)、非何杰金氏淋巴瘤Burkitt淋巴瘤(BL)、Burkitt淋巴瘤(BL)等恶性肿瘤密切相关。EB病毒主要为隐性潜伏感染,不同的潜伏感染模式产生的病毒产物不同。EB病毒与鼻咽癌(NPC)的发生密切相关,为EB病毒感染Ⅱ型隐性感染模式,主要表达LMP1、LMP2、EBNA1、EBER和BamHIA片段的转录物等病毒蛋白产物。其中LMP2可以分为LMP2A与LMP2B两种亚型,LMP2A基因无致癌性,不引发B淋巴细胞的转化,序列保守,已鉴定出多种与HLAⅠ型限制相关的CTL表位,且可以诱导显著的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL),被认为是EBV相关恶性肿瘤的重要靶抗原-EBV仅感染人类,在动物体内感染不会引发鼻咽癌。因此,对EBV LMP2动物模型的构建带来一定的难度,限制了 EBV LMP2相关疫苗特异性免疫应答效果临床前全面系统的评价。单独一种载体疫苗的反复接种,诱导的针对载体自身的免疫应答反应,影响了 LMP2特异性免疫应答反应效果的提高,因此同种靶抗原不同载体疫苗联合使用的序贯免疫治疗具有十分重要的意义。MVA(Modified Vaccinia virusAnkara)因其较好的安全性及免疫原性,被广泛应用于载体疫苗研究。本次研究使用MVA作为载体,构建携带EBVLMP2靶抗原的MVA-LMP2重组疫苗,并评价其诱导的LMP2特异性免疫应答反应,清除肿瘤细胞的效果,以及包含MVA-LMP2重组疫苗在内的序贯免疫应答反应效果。本次实验建立了携带EBV LMP2基因的小鼠肿瘤细胞模型TC-1-GLUC-LMP2,PCR 及 RT-PCR 鉴定结果显示,TC-1-GLUC-LMP2 可以有效地携带并转录EBVLMP2及GLUC基因;Western blot、及流式细胞术的鉴定结果显示,传代30次的TC-1-GLUC-LMP2细胞仍可以稳定表达LMP2与GLUC蛋白,且LMP2蛋白阳性表达水平可达98.7%;生长曲线检测结果显示,LMP2及GLUC基因的插入,对该细胞的生长速度、贴壁活性并无显著影响;TC-1-GLUC-LMP2细胞按照4×106个/只皮下接种小鼠,小动物活体成像仪(in vivo imaging system,IVIS)检测结果显示,随着肿瘤细胞接种时间的延长,肿瘤细胞光子数逐渐增加,提示肿瘤组织不断增大;接种14 d后,检测成瘤组织平均重量、体积分别为0.41 g、220 mm3,且成瘤组织可以有效地表达LMP2蛋白,胞核变大,胞质皱缩,为典型的肿瘤组织。上述结果均说明,本次实验建立的TC-1-GLUC-LMP2小鼠肿瘤模型可以稳定表达LMP2、GLUC蛋白,且接种小鼠后可形成肿瘤组织,GLUC蛋白的稳定表达也为小鼠体内肿瘤组织的实时观察提供了便利。总之,EBV LMP2小鼠肿瘤模型的建立为后续LMP2相关疫苗的抗肿瘤效果评价提供可选肿瘤模型。与此同时,本次实验构建了携带EBV LMP2A全长基因的MVA-LMP2重组载体疫苗,探究其诱导的特异性免疫应答反应效果及清除肿瘤细胞的能力。PCR及Western blot检测结果显示,MVA-LMP2重组病毒已成功携带LMP2基因,稳定的表达LMP2蛋白;按照不同剂量、不同接种次数及不同的检测时间点评价MVA-LMP2重组病毒,检测结果显示MVA-LMP2可以有效的诱导LMP2特异性免疫应答反应,免疫剂量为2×104PFU/只,即可诱导LMP2特异性免疫应答反应,随着接种剂量的提高,特异性免疫应答效果不断升高,且免疫剂量为2×106PFU与2×107PFU诱导的特异性免疫应答反应效果无显著差异(p<0.01,n=6);末次免疫后3w可达LMP2特异性免疫应答反应的峰值,且免疫后10个月仍可检测到特异性免疫应答反应;连续接种4次,间隔2 w再次加强免疫,LMP2特异性免疫应答水平不再升高;此外,流式细胞术检测结果显示,CD3+CD8+CTL细胞中IFN-γ及TNF-α细胞因子所占百分比分别为1.51%,1.42%,显著高于CD3+CD4+CTL细胞中的比例,提示本次构建的MVA-LMP2重组疫苗诱导的特异性免疫应答主要是CD8+T细胞依赖的;ELISA检测MVA-LMP2诱导的LMP2特异性抗体滴度,结果显示疫苗免疫后的小鼠血清稀释240倍,EBVLMP特异性抗体检测结果仍为阳性,提示MVA-LMP2重组疫苗可以有效地诱导 LMP2特异性抗体产生;MVA-LMP2重组疫苗免疫C57BL/6小鼠后接种TC-1-GLUC-LMP2肿瘤细胞,接种14 d肿瘤细胞即可全部清除。以上结果说明,MVA-LMP2重组疫苗感染细胞可以有效地表达LMP2蛋白,显著地诱导CD8+T细胞依赖的LMP2特异性免疫应答反应,有效地杀伤、清除了肿瘤细胞。MVA-LMP2、Ad5-LMP2、pVR-LMP2三种载体疫苗联合使用的序贯免疫结果显示,诱导的LMP2特异性免疫应答反应显著高于两种或单独一种载体疫苗免疫,提示MVA-LMP2重组载体苗的加强免疫,有效地提高了 LMP2特异性免疫应答效果,强调了序贯免疫治疗的重要意义,同时也为LMP2相关疫苗的序贯免疫治疗提供候选疫苗。综上,本次实验成功建立了携带LMP2靶抗原及GLUC标记基因的EBV LMP2小鼠肿瘤细胞模型,即TC-1-GLUC-LMP2,可以稳定地表达LMP2及GLUC蛋白,为LMP2相关疫苗免疫效果的临床前全面系统的评价提供可选肿瘤模型,使小鼠体内肿瘤细胞的实时动态监测成为可能;成功构建了携带LMP2A全长基因的MVA重组病毒,即MVA-LMP2,稳定地携带LMP2基因,显著地诱导了LMP2特异性免疫应答反应,有效地清除了小鼠体内肿瘤细胞,为LMP2相关恶性肿瘤治疗提供了候选疫苗;pVR-LMP2、Ad5-LMP2及MVA-LMP2重组疫苗的序贯免疫治疗检测结果表明,MVA-LMP2重组病毒的加强免疫,显著地提高了LMP2特异性免疫应答效果,提示同种靶抗原不同载体的序贯免疫治疗对提高特异性免疫应答效果的重要意义,为后续LMP2相关疾病的序贯免疫治疗提供参考。