蜂毒自从公元前二世纪就已经作为一种治疗剂，含有溶血肽、镇静肽、蜂毒明肽、透明质酸酶、磷酸脂酶A2等多种肽和酶，具有抗炎、抗菌、消毒、溶血等功能作用，并且已广泛应用于医药、化工、临床、食品等多个行业与领域。　　中华蜜蜂(简称中蜂)是我国特有的蜂种，因其独特的生物学特性及在我国生态链中的传花授粉作用，其蜂毒的研究与应用也正向分子机制方面纵深发展，传统上其功能的研究多建立在经验之上而应用于医学药理，并已在临床中得到应用。卡尼鄂拉蜂(简称卡蜂)是西方蜜蜂的四大优良蜂种，在维持强群及蜜蜂守卫能力方面较强，也是我国饲养的主要西方蜂种之一；东北黑蜂(简称黑蜂)是在长期的自然环境下形成，具有高加索蜂和卡尼鄂拉蜂血统的蜂种。我国北方特区及特殊生态环境下生存的西方蜂种，拥有超强的抗低温能力及环境适应能力。因此，克隆不同蜂种的蜂毒功能成份并在合适的真菌宿主中高效表达以大量制备生产相关功能成份，对于开发天然毒素和加快天然产物的应用具有十分重要的意义。　　本研究从不同蜂种的蜂毒中克隆了溶血肽基因、镇静肽基因、透明质酸酶、磷脂酶A2基因。采用食用菌启动子构建了溶血肽、镇静肽、透明质酸酶、磷脂酶A2基因的表达载体，利用原生质体共转化法转化高等真菌一灰盖鬼伞，研究不同蜂种来源的蜂毒功能成份基因差异及在灰盖鬼伞中的表达。主要结果如下：　　(1)克隆了中华蜜蜂的蜂毒溶血肽、镇静肽基因。采用RT-PCR方法从中华蜜蜂蜂毒组织中扩增出溶血肽、镇静肽基因。它们的全长分别为213bp、225bp，分别编码71、75个氨基酸。同源性比对结果显示，这两个基因以及推测的氨基酸序列与已报道的意大利蜜蜂的溶血肽、镇静肽基因均为99％。　　(2)克隆了东北黑蜂的蜂毒组织的溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2基因。它们的全长分别为213bp、234 bp、507bp，分别编码71、78、169个氨基酸。核发酸序列比对结果表明，溶血肽、镇静太、磷脂酶A2与意大利蜜蜂溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2核酸序列同源性均为99％。3个基因的推测氨基酸序列与已报道的意大利蜜蜂的溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2的同源性分别为96％、98％、99％。已将该3个基因登录美国NCBIGenBank，其登录号为东北黑蜂溶血肽基因JQ900378、镇静肽基因JQ900379、磷脂酶A2基因JQ900380。　　(3)克隆了卡尼鄂拉蜂蜂毒组织的溶血肽、镇静肽、透明质酸酶、磷脂酶A2基因。它们的全长分别为213bp、234bp、1146bp、504bp，分别编码71、78、382、168个氨基酸。同源性分析表明，溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2、透明质酸酶与意大利蜜蜂溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2、透明质酸酶核酸序列同源性分别为99％、99％、96％、99％。4个基因的推测氨基酸序列与已报道的意大利蜜蜂的溶血肽、镇静肽、磷脂酶A2、透明质酸酶的同源性分别为96％、98％、91％、99％。已将该4个基因登录美国NCBI GenBank，卡尼鄂拉蜂溶血肽基因、镇静肽基因、磷脂酶A2、透明质酸酶基因的登录号分别为JQ867103、JQ906198、JQ900376、JQ900377。　　(4)构建了中华蜜蜂溶血肽基因、镇静肽基因，卡尼鄂拉蜂镇静肽基因、透明质酸酶基因、磷脂酶A2基因的表达载体。利用克隆的中华蜜蜂溶血肽基因、镇静肽基因，卡尼鄂拉蜂镇静肽基因、透明质酸酶基因、磷脂酶A2基因和食用菌gpd启动子gpd-Les(香菇gpd，613 bp)连接，同时以表达载体pCc1001为框架，构建蜂毒功能基因表达载体。重组质粒经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，这5个表达载体分别命名为pgLes-zr、pgLes-zz、pgLes-kz、pgLes-kt、pgLes-kp。　　(5)获得了多个转卡尼鄂拉蜂镇静肽的灰盖鬼伞工程菌株，首次实现蜂毒镇静肽基因的真核表达。采用PEG介导的原生质体转化方法，分别将食用菌基因表达载体pgLes-zr、pgLes-zz、pgLes-kz、pgLes-kt、pgLes-kp与灰盖鬼伞恢复载体pCc1001共转化灰盖鬼伞色氨酸营养缺陷型菌株(LT2)。其中只有卡蜂镇静肽表达载体质粒获得12个拟转化子，拟转化子经过PCR鉴定、SDS电泳及Southern杂交鉴定，有目的基因的转化子有3个，其共转化率为25％。首次实现了镇静肽基因在真核生物的表达研究。　　(6)表达产物的鉴定与相应蛋白活性验证。通过对转化获得的转化子进行大量培养后，采用灰盖鬼伞粗蛋白提取方法对总蛋白进行粗提，粗提后的蛋白与空白对照蛋白同时进行小分子量蛋白电泳，结果显示，在8KDa条带附近，3个转化子蛋白均有目标条带，而空白对照蛋白(LT2)并未出现此条带。同时，利用粗提的目标蛋白，采用双层抑菌法进行目的蛋白的抑菌实验，证实镇静肽有抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌最为敏感，对于大肠杆菌抑菌性较弱。