卵巢组织冷冻保存已经成为生殖医学领域研究的热点。冻融后的卵巢组织主要用于移植或体外培养。对于恶性肿瘤患者来说,自体移植显然是不合适的,而异种移植又受到伦理以及动物源性传染病的限制。体外培养又分为卵巢组织体外培养和卵泡体外培养。大量动物实验研究表明,卵巢组织体外培养可以保存完整的卵泡结构以及卵泡与组织间的相互作用,成为探索新鲜或冻融卵巢组织中卵泡生长发育的重要研究模型。但是,由于人卵巢皮质中卵泡的分布不均匀,仅靠冷冻前的组织形态学分析很难估计冷冻组织块中的卵泡数量,卵巢组织块中卵泡含量的不确定性大大降低了卵巢组织体外培养的价值。分离后卵泡的体外培养因能够为辅助生殖技术提供实实在在的卵母细胞来源而优于卵巢组织体外培养。目的本研究采用直接覆盖玻璃化冷冻法冻存人类卵巢组织,解冻后分离卵泡,完整存活卵泡行体外培养,使用藻酸钙作为三维培养体系,在体外培养液中添加干细胞因子(stem cell factor, SCF,又称kit配体)及白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF),以探讨体外培养条件下LIF与SCF对人原始卵泡生长发育的影响,研究最佳的体外培养条件。为构建人类卵子库提供基础研究。方法人卵巢组织冷冻方案基本参照Chen等报道的直接覆盖玻璃化冷冻方案(DCV)。1.将所收集的18例卵巢组织分割成lmm×1mm×2mm的组织块,随机留2-3块新鲜组织10%中性甲醛固定,部分新鲜组织用于分离卵泡,其余组织全部用于直接覆盖玻璃化冷冻保存；2.解冻后的卵巢组织随机留2-3块10%中性甲醛固定,其余组织全部用于分离卵泡；3.选取形态正常的卵泡随机分成5组,添加不同成分的培养液,在藻酸钙三维培养体系中体外培养8d。隔天半量换液,收集培养液置于-20℃冰箱保存,采用电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)测定雌二醇水平；0d、4d、8d测卵泡直径；台盼蓝染色评价卵泡活率。4.采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。结果1.卵巢组织冷冻前后组间各级卵泡构成比例差异无统计学意义(P>0.05),组内各级卵泡构成比例差异有统计学意义(P<0.05),人卵巢组织中的卵泡主要为原始卵泡,其次为初级卵泡和次级卵泡,未见窦状卵泡,且卵泡在组织中的分布不均匀；2.冷冻前后原始卵泡中异常卵泡所占比例无统计学差异(P>0.05)。各组内原始卵泡与初、次级卵泡相比,差异有统计学意义(P<0.05),冷冻后初、次级卵泡的损伤程度较冷冻前增加,但差异无统计学意义(P>0.05)；3.冷冻前后分离的卵泡绝大部分存活,冷冻过程对分离的各级卵泡的存活率比较差异无统计学意义(P>0.05),但初、次级卵泡存活率较原始卵泡存活率偏低；4.随着培养天数的增加,对照组卵泡直径增长缓慢,明显小于各实验组(P<0.05)；而在实验组中,SCF和LIF联合培养组中卵泡直径增长迅速,较单独培养组差异有统计学意义(P<0.05),联合培养组中,不同浓度的SCF组中卵泡直径的增长速度相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)；单独SCF和LIF组相比,卵泡生长速度差异无统计学意义(P>0.05)；5.随着培养天数的增加,各组卵泡都具有分泌激素的功能。4天后对照组卵泡激素水平增长缓慢,明显小于各实验组(P<0.05),而在实验组中,SCF和LIF联合培养组中卵泡激素分泌增长迅速,较单独培养组差异有统计学意义(P<0.05),联合培养组中,不同浓度的SCF组中卵泡的激素增长速度相差不大,但在第4天差异有统计学意义(P<0.05)；单独SCF和LIF组相比,卵泡激素水平差异无统计学意义(P>0.05)；6.体外培养8d后,采用台盼蓝染色评价各组卵泡的存活率,对照组的卵泡存活率明显低于实验组(P<0.05),而各实验组相比卵泡存活率无明显差异(P>0.05)。结论1.直接覆盖玻璃化冷冻法操作简单,耗时短,能够很好的保存人卵巢组织中的卵泡,可用于人类卵巢组织的冷冻保存；2.冷冻过程对原始卵泡无明显损伤,但对初、次级卵泡可造成一定程度的损伤；3.藻酸钙能够维持卵泡的完整结构,维持细胞间的缝隙连接,可以作为三维培养体系用于分离卵泡的体外培养；4.酶联合机械分离卵泡的方法可以减轻单用酶对基底膜和卵泡膜所造成的损伤,使分离的卵泡保持良好的活性；5.在体外培养液中添加SCF和(或)LIF有利于促进卵泡的生长发育,提苛卵池存活率和雌二醇分泌功能,且SCF和LIF的联合作用更加明显。