研究背景:子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)简称内异症,发病率约占生育年龄妇女的15%,近年来有明显上升趋势。内异症所引起的痛经、下腹痛及不孕症,严重地影响了妇女的健康和生活质量,其病变广泛,形态多样,且有浸润性生长、广泛种植转移和易复发的恶性生物学行为,是一种常见且难治的妇产科疾病。目前诊断主要以微创的腹腔镜检查为金标准,但缺乏特异性的生化指标;治疗方法主要采用外科去势手术和激素治疗,这些方法虽对减轻症状,促进妊娠有一定帮助,但效果有限,副作用明显,且易复发,无法根治。影响内异症临床治疗效果的主要原因是本病的发病机制不清楚。因此,内异症发病机制的研究是当前妇产科基础研究的热点之一。己有的研究表明异位内膜的转移、种植、生长等类似肿瘤转移的生物学行为是内异症发病关键。核转录因子kappaB(NF-κB)是一种广泛存在的多效性的核转录因子,为Rel蛋白家族成员,由多肽P50和P65亚基形成同源或异源性二聚体。在静息细胞,NF-κB主要位于细胞浆,与具有抑制作用的IκB家族结合,其锚蛋白重复序列掩盖了NF-κB的DNA结合位点而干扰NF-κB的功能,在受到生理或有害刺激后,依靠信号传导系统由无活性状态转变为活性状态,激活后的NF-κB从NF-κB-IκBs复合物中解离,进入细胞核,与相应的靶基因结合,启动转录。其活化过程不需要合成新的蛋白,故能及时引起细胞反应早期的功能变化,继发引起其他因子的产生和活化。NF-кB可高效诱导多种前炎性细胞因子、白细胞粘附分子、单核细胞趋化因子等基因的表达,同时对参与炎症级联及放大效应的多种酶的基因转录也具有重要的调控作用。NF-кB的过度激活可引起一系列炎症相关性疾病,如哮喘、类风湿性关节炎、肠炎、癌症等,已引起人们的高度重视。上皮细胞来源的中性粒细胞活化肽-78(简称ENA-78)是一种重要的趋化因子及血管形成因子,其可趋化中性粒细胞到达病灶以及直接促进异位内膜细胞的增殖,近年来对其在内异症发病中的作用日益受到重视。研究表明,ENA-78是NF-кB的下游基因,是受到NF-кB调控的基因。但是NF-кB对ENA-78的调控在内异症中是否起作用尚不清楚。第一部分子宫内膜异位症体外细胞模型的建立研究对象正常妇女的子宫内膜细胞;子宫内膜异位症患者的在位及异位内膜细胞目的探索人正常、在位及异位子宫内膜细胞体外原代及传代培养的方法,建立子宫内膜异位症体外细胞模型方法收集子宫内膜异位症和正常妇女的在位及异位子宫内膜,采用胶原酶和铜网过筛法及差时贴壁等方法分离子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,进行单层培养。倒置显微镜观察细胞生长形态,免疫细胞化学进行细胞鉴定,MTT法绘制细胞生长曲线。结果子宫内膜腺上皮细胞(Endometrial epithelial cell ,EEC)和基质细胞(Endomet -rial stromal cel1 ,ESC)分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性,腺上皮可持续培养4-6周,传代2-3次;基质细胞可持续培养5-8周,传代4-6次。结论采用胶原酶消化、筛网二次过滤和贴壁纯化等方法,分离出高纯度的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞而没有细胞特征的改变。可为研究子宫内膜异位症相关病理生理机制提供满意的体外细胞平台。第二部分NF-KBp65蛋白、ENA-78在子宫内膜异位症发病中的作用研究目的检测核因子kappaBp65蛋白及ENA-78在内异症患者在位内膜、异位内膜和正常子宫内膜中的表达情况,探讨上述因子与内异症发病的关系。方法(1)体外传代培养至第3代的在位、异位及正常内膜细胞分别给予不同浓度的IL-1β及IL-1β+二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC)进行干预。用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测三组子宫内膜培养上清液ENA-78浓度及IL-1β、IL-1β+PDTC对各组内膜基质细胞分泌ENA-78浓度的影响。(2)用免疫细胞化学方法检测三组子宫内膜细胞NF-KBp65蛋白的活化程度及IL-1β、IL-1β+PDTC干预下各组内膜基质细胞NF-KBp65蛋白的活化程度的改变。结果(1)在位及异位子宫内膜细胞培养上清液中ENA-78浓度明显高于正常子宫内膜细胞,差异有显著统计学意义(P<0.01);在位及异位子宫内膜细胞之间比较,异位子宫内膜细胞培养上清液中的ENA-78浓度高于在位子宫内膜细胞,差异有显著统计学意义(P<0.01),在分别给予IL-1β、IL-1β+PDTC干预后,正常子宫内膜细胞上清液中的ENA-78浓度无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);而在在位及异位内膜细胞的上清液中,ENA-78浓度在IL-1β组最高,明显高于对照组及IL-1β+PDTC组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。(2)在子宫内膜细胞、在位及异位子宫内膜细胞这三组中,在位内膜细胞及异位内膜细胞的NF-KBp65蛋白的活化程度显著高于正常子宫内膜细胞,差异有统计学意义(P<0.05);在位及异位子宫内膜细胞NF-KBp65蛋白的活化程度IL-1β组最高,显著高于对照组及IL-1β+PDTC组,差异有统计学意义。IL-1β能显著诱导内异症异位及在位内膜间质细胞NF-кB的活化,这种作用能被PDTC所抑制。PDTC能明显抑制IL-1β诱导内异症异位及在位内膜基质细胞分泌ENA-78的作用。结论(1)NF-кBp65、ENA-78可能在内异症发病中起作用。(2)IL-1β可诱导在位及异位子宫内膜细胞NF-кBp65活化,使ENA-78的表达增高。PDTC可抑制此作用,说明NF-кBp65做为关键性的调控因子,可能在内异症的发病过程中起到“闸门”的作用,对ENA-78以及其它细胞因子起到中枢样调控作用。(3)在位内膜本质的先天性差异可能是内异症发病的关键。