一、背景与目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作为我国最常见的恶性肿瘤之一,在临床上发病率和致死率都很高。复发转移是影响HCC病人长期生存的根本原因。因此,深入研究HCC发生、发展和转移的分子机制,筛选HCC的关键靶点具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA(long no-coding RNAs,lncRNAs)是近些年发现的与肿瘤的发生发展密切相关的一类不具有蛋白编码功能 RNA 分子。Linc-ROR(large intergenic ncRNA-regulator of reprogramming,linc-ROR)是最新发现的对细胞重编程过程具有重要调控作用的长非编码RNA。现有的研究表明,linc-ROR在诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)形成、DNA损伤、氧化应激等过程中发挥重要的作用,但其具体的作用机制尚不明确。研究表明,lncRNAs可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)竞争结合miRNAs,抑制miRNAs的活性与功能,从而在转录后水平调节miRNAs相关靶基因mRNAs的表达。文献报道linc-ROR在乳腺癌、膀胱癌、肺癌等肿瘤中高表达并且与肿瘤的恶性进展密切相关,显示了其作为肿瘤生物治疗靶点的潜在应用价值,但其在HCC中的功能角色以及潜在分子作用机制尚未见文献报道。本研究旨在探寻linc-ROR在HCC中的表达模式及临床意义,分析linc-ROR表达变化对HCC侵袭转移的影响,并深入探讨linc-ROR/miRNA/mRNA调控网络在HCC侵袭转移过程中的作用机制,为寻找HCC新的治疗靶点提供实验依据。二、材料、方法与结果第一部分Linc-ROR在HCC中的表达及临床意义方法::1、收集88例原发性HCC组织和对应的癌旁组织,从中选取20例,实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测 linc-ROR 的表达水平。进一步在全部88例HCC组织中检测linc-ROR的表达水平。2、在全部88例HCC组织中结合临床信息分析linc-ROR的表达水平与HCC患者临床病理特征及预后的相关性。结果:1、与对应的癌旁组织相比,20例HCC组织中linc-ROR的表达水平明显增高(p<0.001)。2、在HCC临床组织样本中,linc-ROR的表达水平与HCC患者是否具有淋巴结转移(p<0.001)、血管侵袭(p<0.001)、TNM分期(p<0.001)以及是否具有肿瘤复发(p<0.01)密切相关;采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现,相对低表达linc-ROR组,高linc-ROR表达水平预示着总生存期(p<0.01)和无病生存期(p<0.01)明显缩短。第二部分Linc-ROR对HCC细胞生物学特性的影响方法:1、在侵袭转移能力不同的一系列人HCC细胞株(HepG2、SMMC-7721、HCCLM3和MHCC97-H)中运用实时定量RT-PCR检测linc-ROR的表达水平。2、构建针对linc-ROR的慢病毒过表达载体和RNA干扰载体,病毒包装及滴度测定后,分别感染低侵袭和高侵袭细胞并进行稳定筛选(HepG2/linc-ROR和SMMC-7721/linc-ROR、HCCLM3/shROR 和 MHCC97-H/shROR),人为改变细胞内linc-ROR表达水平,运用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测不同组细胞迁移与侵袭能力的差异。3、收集可稳定过表达linc-ROR的HepG2/linc-ROR细胞株以及稳定低表达linc-ROR的HCCLM3/shROR细胞株,建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物取出肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并分别比较其与对照组的肝内转移和肺转移情况的差异。4、运用western blot和免疫荧光实验检测linc-ROR表达改变后HCC细胞中EMT分子标志物的表达差异。结果:1、在正常肝细胞株HH中,linc-ROR的表达水平最低,低侵袭性HCC细胞株HepG2和SMMC-7721次之,高侵袭性肝癌细胞株HCCLM3和MHCC97-H中,linc-ROR的表达水平最高(p<0.01)。2、在HepG2和SMMC-7721细胞中人为上调linc-ROR表达水平,可促进细胞的体外迁移和侵袭能力(p<0.01)。相反,HCCLM3/shROR和MHCC97-H/shROR细胞的体外迁移和侵袭能力与对照组(HCCLM3/shCtrl和MHCC97-H/shCtrl)相比明显下降(p<0.01)。3、在HepG2/linc-ROR细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内转移和肺转移结节的数目与对照组HepG2/Vector相比均明显增加,而由HCCLM3/shROR细胞建立的裸鼠原位肝癌模型则提示细胞的体内转移能力受到抑制(p<0.01)。4、在HepG2和SMMC-7721细胞中人为上调linc-ROR表达水平后,细胞中上皮分子标志物(E-cadherin和β-catenin)表达水平下降,间质分子标志物(N-cadherin 和 Vimentin)表达水平上升。相反,在 HCCLM3 和 MHCC97-H细胞中人为下调linc-ROR表达水平后,细胞中上皮分子标志物(E-cadherin和β-catenin)表达上升,间质标志物(N-cadherin和Vimentin)表达下降。提示linc-ROR的表达可影响HCC细胞的EMT过程第三部分Linc-ROR/miR-145/ZEB2信号轴调控HCC侵袭转移的作用机制方法:1、根据已有文章报道并结合生物信息学软件研究分析出可与linc-ROR发生作用的miRNA分子,筛选出linc-ROR的靶目标,实时定量RT-PCR分析linc-ROR的表达变化对此miRNA的影响以及此miRNA表达变化是否对linc-ROR产生影响。2、双荧光素酶报告试验、RIP试验以及RNA绝对定量实验验证linc-ROR与miRNA在细胞内结合并且充当分子海绵发挥作用。3、合成miRNA的mimics和inhibitor转染对应HCC细胞株,运用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验、wstem blot以及免疫荧光实验检测miRNA的生物学功能。利用拯救实验,分析linc-ROR能否通过吸附miRNA实现生物学功能。4、实时定量RT-PCR与western blot分析linc-ROR、miRNA对其靶基因的mRNA及蛋白表达的影响。检测HCC组织标本中miRNA及靶基因的表达水平变化,分析linc-ROR、miRNA以及靶基因三者表达之间的相关性。结果:1、生物信息学预测linc-ROR序列中存在可与miR-132、miR-133、miR-145-5p、miR-181a、miR-19a-5p、miR-200b、miR-205-5p、miR-214、miR-219-5p、miR-320c、miR-34a-5p、miR-454、miR-520c-3p、miR-99b-3p 及 let-7a-l 互补结合的MREs;在干扰了 linc-ROR表达的HCC细胞中,miR-145表达升高最明显(4.73 倍)。与对照组相比,HepG2/linc-ROR 和 SMMC-7721/linc-ROR细胞株中miR-145的表达明显下降(p<0.01),而HCCLM3/shROR和MHCC97H/shROR细胞中miR-145的表达明显升高(p<0.01);另一方面,在HCC细胞中改变miR-145的表达水平并不影响linc-ROR的表达。2、构建linc-ROR的双荧光素酶报告载体,与miR-145/mimics共转染肿瘤细胞,证实二者可通过MREs互补结合;RIP实验进一步提供了 linc-ROR与miR-145直接结合的证据;最后RNA绝对定量实验分析了 linc-ROR具有足够的表达丰度发挥分子海绵的作用。3、MiR-145可抑制HCC细胞的侵袭转移能力以及抑制EMT过程;而拯救实验证明miR-145表达改变可以部分逆转linc-ROR表达对HCC细胞迁移、侵袭和转移能力以及EMT过程的调控作用。4、Linc-ROR过表达可以上调miR-145的靶基因ZEB2 mRNA和蛋白的表达,同时共转染miR-145/mimics后可部分恢复ZEB2 mRNA和蛋白的表达;干扰linc-ROR表达可以使miR-145的靶基因ZEB2 mRNA和蛋白的表达下降,共转染miR-145/inhibitor后可部分逆转这一表达变化。在HCC组织标本中,miR-145的表达水平明显降低(p<0.01),与linc-ROR的表达呈显著负相关(r=-0.716);而ZEB2的表达水平明显增高(p<0.001),与linc-ROR的表达呈显著正相关(r=0.804)。三、结论与意义1、Linc-ROR在HCC组织中呈高表达,且与患者淋巴结转移、血行转移、TNM分期、肿瘤复发情况以及临床预后相关2、Linc-ROR作为一个癌基因可在体内、外促进HCC细胞的侵袭转移能力,诱导EMT过程。3、Linc-ROR可作为ceRNA竞争性结合miR-145从而诱导ZEB2表达水平的上调,最终促进HCC侵袭、转移和诱导EMT过程。4、本课题以linc-ROR为重点研究对象,分析了 linc-ROR在HCC细胞中的表达以及其与临床病理特征和预后的关系,验证了 linc-ROR对HCC细胞迁移、侵袭和EMT过程的影响,并探讨了 linc-ROR在肝细胞癌中发挥作用的分子机制,为肝细胞癌侵袭转移的预防和治疗提供了新的分子靶点和治疗策略。