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目的:本研究采用DSS法复制小鼠复发性结肠炎模型,在评价人参皂苷Rg1对小鼠结肠炎疗效的同时,观察小鼠肠道菌群结构和巨噬细胞极化状态的改变,并从Nogo-B/Rho A信号通路的角度,探究人参皂苷Rg1调节巨噬细胞极化和肠道菌群平衡治疗小鼠结肠炎的可能作用机制。方法:1.动物模型复制和给药方法:将60只SPF级雄性BALB/C小鼠随机分为6组,每组10只,正常组(Normal),模型组(DSS),高剂量(200 mg·kg-1)人参皂苷Rg1组(DSS+Rg1-H),中剂量(100 mg·kg-1)人参皂苷Rg1组(DSS+Rg1-M),低剂量(50 mg·kg-1)人参皂苷Rg1组(DSS+Rg1-L)和美沙拉嗪组(5-ASA)。用超纯水配制3%(w/v)DSS(35 000-50 000 k D)溶液,除正常组小鼠,其余各组小鼠均给与3%DSS溶液自由饮用,连续5天。后正常饮水1周,再饮用2%DSS溶液5天,正常组给与正常饮水。以小鼠第一次饮用3%DSS为第1天,第11天开始正常组与模型组按照体重给予超纯水灌胃,人参皂苷Rg1高中低剂量组按照体重给予200 mg·kg-1,100 mg·kg-1,50 mg·kg-1人参皂苷Rg1溶液灌胃,美沙拉嗪组按照体重300 mg·kg-1给予美沙拉嗪肠溶片混悬液灌胃。再将40只SPF级雄性BALB/C大鼠随机分为4组,每组10只,正常组,模型组,人参皂苷Rg1组(DSS+Rg1)和Y27632组(DSS+Y27632)。模型复制方法同上,给药方法同上,人参皂苷Rg1按照体重200 mg·kg-1给予人参皂苷Rg1溶液灌胃,Y27632组按照体重10 mg·kg-1给予Y27632溶液灌胃,每日固定时间段给药,共持续10天。2.人参皂苷Rg1治疗DSS诱导复发性结肠炎的疗效评价:每日观察小鼠体质量,进食饮水情况,毛发状况与活动指数。将小鼠麻醉处死后对结肠质量,结肠长度进行测量,并计算结肠质量指数,单位结肠质量,制作结肠病理切片,在显微镜下观察结肠病理状况,进行损伤评分。通过ELISA方法对小鼠结肠IL-6、CCL-2、TNF-α、TGF-β1、IL-4、IL-10、IL-13和IL-33炎性因子进行检测。3.肠道菌群测序:在灭菌条件下,获取小鼠回盲部粪便,快速放于干冰中再转移至-80℃保存。之后通过DNA抽提和PCR扩增对粪便测序获取碱基序列,与基因库对比,获取菌群信息。探索肠道菌群与结肠炎相关性,以及人参皂苷Rg1对菌群的调控作用,并采用WB法检测TLR2蛋白在结肠内表达情况。4.巨噬细胞极化分析:采用流式细胞术对M1型巨噬细胞i NOS、Tim-1、TLR-4,M2型巨噬细胞CD163、CD206测定,探究人参皂苷Rg1能否通过调节巨噬细胞极化治疗DSS诱导的小鼠结肠炎。5.Nogo-B/Rho A信号通路和巨噬细胞相关蛋白检测:采用WB方法对Nogo-B/Rho A信号通路Rock 1、Rho A和Nogo-B蛋白,巨噬细胞相关蛋白Arg-1、MIF-1和PIM-1进行检测,探究人参皂苷Rg1对Nogo-B/Rho A信号通路调控作用。6.统计学分析:采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析;计量资料以均数±标准差(sx±)表示;使用单因素方差分析确定显著性,然后进行多重比较的Tukey检验;以P<0.05表示差异具有显著性,以P<0.01表示差异具有极显著性。结果:1.人参皂苷Rg1治疗结肠炎有效剂量:与正常组比较,模型组小鼠在第3天开始出现体重下降,行动迟缓,大便溏稀,食欲不振的现象,至第5天小鼠肛门处肉眼可见明显便血,停止饮用DSS后小鼠体重逐渐恢复。与模型组比较,在人参皂苷Rg1高中低剂量和美沙拉嗪组给药后体重恢复速度加快。二次饮用DSS时,治疗组体重下降较模型组相比较更为缓慢,通过对体质量,结肠质量,结肠长度等数据进行统计分析发现人参皂苷Rg1高剂量治疗效果比中剂量和低剂量更为有效。提示人参皂苷Rg1可以有效治疗小鼠复发性结肠炎并以高剂量效果最佳。2.人参皂苷Rg1治疗结肠炎疗效评价:模型组与治疗组相比体质量、结肠质量显著上升,与模型组相比较治疗组结肠长度得以恢复。在对单位结肠质量进行比较时发现模型组与其他组比较显著上升(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比,人参皂苷Rg1结肠质量指数显著降低(P<0.05或P<0.01),Y27632组有降低趋势但无显著性差异,与正常组和治疗组相比较,模型组病理损伤评分显著升高(P<0.05或P<0.01)。对结肠组织病理切片观察发现正常组小鼠的结肠黏膜排列整齐,无炎性细胞浸润。与正常组比较,DSS模型组小鼠的大面积溃疡且至粘膜下层,腺体排列紊乱并部分缺失,血管增生,大量炎性细胞浸润并伴有水肿。人参皂苷Rg1组及Y27632组有少许炎性细胞浸润,小面积溃疡,腺体整齐可见腺体增生修复。对炎性细胞检测时发现模型组IL-6,IL-33和CCL-2水平升高具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),与模型组相比较人参皂苷Rg1组和Y27632组IL-6,IL-33,CCL-2和TNF-α水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。人参皂苷Rg1组与模型组相比较,TGF-β1、IL-4、IL-10和IL-13显著增加(P<0.05或P<0.01),Y27632组TGF-β1、IL-4和IL-13显著增加(P<0.05或P<0.01)。提示人参皂苷Rg1对可能通过调节炎性细胞因子治疗结肠炎。3.肠道菌群研究:对肠道菌群测序发现,与正常组相比较模型组多样性降低,并且独有菌群数量减少,模型组优势物种有葡萄球菌(Staphylococcus),脆弱拟杆菌(Bacteroides),真杆菌(Eubacterium)＿fissicatena＿group且丰富度具有显著性(P<0.05或P<0.01)。同样毛螺菌科(Lachnospiraceae)＿NK4A136＿group,unclassified＿f＿＿Lachnospiraceae,norank＿f＿＿Lachnospiraceae,在正常组和人参皂苷Rg1中丰富度显著增加,Y27632组的菌群丰度大部分与模型组趋于一致。表明结肠炎小鼠体内肠道菌群发生紊乱,致病菌增加,有益菌减少,菌群丰度降低。TLR2在模型组表达显著增加(P<0.05或P<0.01),与肠道菌群进行关联性分析,发现模型组菌群与TLR2蛋白关系最为密切,正常组菌群与TLR2蛋白关系较远。表明肠道菌群紊乱可以导致TLR2高水平表达,人参皂苷Rg1可能通过调节肠道菌群,降低TLR2表达治疗结肠炎,而Y27632没有对菌群的调节作用。4.巨噬细胞极化检测:通过流式细胞术对巨噬细胞进行检测,与模型组相比,治疗组M1型巨噬细胞i NOS、Tim-1、TLR-4表达降低(P<0.05或P<0.01),M2型巨噬细胞CD163、CD206表达升高,具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。表明人参皂苷Rg1可以有效调节巨噬细胞极化。5.Nogo-B/Rho A信号通路和巨噬细胞相关蛋白检测:采用WB法检测结肠蛋白,与模型组相比较,治疗组Arg-1表达显著增加(P<0.05或P<0.01),MIF-1、PIM-1、Rock 1、RhoA和Nogo-B蛋白表达都显著下降(P<0.05或P<0.01),提示人参皂苷Rg1可以抑制Nogo-B/Rho A信号通路蛋白。结论:人参皂苷Rg1有效治疗DSS诱导结肠炎可能是通过调节肠道菌群平衡,并抑制Nogo-B/Rho A信号通路调控巨噬细胞极化来实现的。