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人体基本的生命活动需要胆固醇，其代谢异常通常会导致诸多严重危害人类健康的疾病。胞内胆固醇转运对于细胞获取胆固醇并维持正常分布至关重要。除自身合成外，细胞可通过受体（low-density lipoprotein receptor, LDLR）介导的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）内吞与NPC1L1(Niemann Pick C1 Like1)依赖的游离胆固醇吸收获得外源胆固醇。LDLR和NPC1L1均以囊泡内吞的方式转运胆固醇进入细胞。进入细胞内的胆固醇会被继续转运到高尔基体、内质网和质膜等细胞区域发挥功能。已知NPC1(Niemann-Pick type C1)和NPC2(Niemann-Pick type C2)蛋白在胆固醇转运出溶酶体的过程中发挥关键作用。然而，目前对参与胆固醇转运的蛋白及作用机制还所知甚少。 我们首先利用慢病毒插入诱变结合Amphotericin B处理筛选参与细胞内胆固醇转运的关键蛋白。对得到的胆固醇转运缺陷的变异细胞鉴定分析，证明慢病毒正向整合进Npc1基因的6号内含子，结果严重干扰了NPC1蛋白的表达。在使用cDNA文库进行的筛选中我们意外获得两株自发突变引起胆固醇转运缺陷的细胞。这两株细胞都表现出NPC2蛋白分泌增加而细胞内含量显著降低的特征。通过转录组测序(RNA-seq)发现变异细胞Vps53(vacuolar protein sorting53homolog)基因的编码区发生移码突变。功能分析表明正是VPS53蛋白的缺失导致溶酶体定位的NPC2减少，从而阻碍胆固醇转运出溶酶体。VPS53作为GARP(Golgi-associated retrograde protein)复合物的亚基参与逆向运输过程，确保CI-MPR(cation-independent mannose-6-phosphate receptor)在反面高尔基网(transGolgi network，TGN)和溶酶体之间循环从而能够分选新合成的NPC2蛋白到溶酶体。逆向运输缺陷会使部分CI-MPR滞留在溶酶体无法回到TGN，继而导致NPC2的错误分选。除此以外，我们发现带荧光标记的胆固醇Bodipy-cholesterol与溶酶体β-己糖胺酶可作为Niemann-Pick typeC(NPC)疾病的潜在标志物。 接头蛋白ARH(autosomal recessive hypercholesterolemia)与Dab2(Disabledhomolog2)识别LDLR的内吞信号序列并招募clathrin/AP2起始内吞。实验室前期工作发现另一接头蛋白Numb（protein numb homolog）可以特异地结合NPC1L1 C端的信号序列而促进内吞，调节小肠胆固醇吸收。我们系统地研究了这三个接头蛋白ARH、Dab2以及Numb在LDLR和NPC1L1介导的质膜胆固醇向细胞内转运过程中的功能。结果发现ARH与Dab2不结合NPC1L1而且对其内吞也并不是必需的。类似地，Numb也不具备结合LDLR参与LDL吸收的功能。并且，只有携带短PTB(phosphotyrosine binding)结构域的Numb能够介导NPC1L1的内吞。除先前报道的在小肠胆固醇吸收中的功能外，Numb同样调节肝脏对胆汁胆固醇的重吸收。我们从低LDL胆固醇人群中鉴定出Numb的G595D变异。G595D由于削弱了Numb与clathrin/AP2的亲和力，会抑制NPC1L1的内吞及胆固醇吸收。因此，Numb特异地调节小肠和肝脏中NPC1L1介导的胆固醇吸收，区别于参与LDL吸收的ARH和Dab2。尽管NumbL蛋白(Numb-likeprotein)与Numb十分相似，但是NPC1L1依赖的胆固醇吸收并不需要NumbL。此外，我们还筛选出28种能够抑制NPC1L1内吞的小分子化合物。 综上所述，本篇论文工作筛选出参与细胞内胆固醇转运的新蛋白并深入阐述了作用机制，探讨了质膜胆固醇向细胞内转运相关蛋白的特异性，同时拓展了其生理功能。以上研究成果有助于加强对胆固醇代谢的认识，并为相关疾病的诊疗提供了思路和方法。