奶山羊产业是我国奶业发展的重要组成部分,而目前我国优质高产奶山羊存栏量不足,良种问题成为奶山羊种业发展面临的重大挑战。在生产中充分发挥优秀种公羊的繁殖力,对于奶山羊群体的遗传改良具有显著作用。雄性动物繁殖力依赖于精子发生,且在睾丸曲细精管中进行,包含精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂以及圆形精子细胞变形等过程,受到极其严格且精密的分子调控。当前高通量测序技术的发展使得人们进一步认识到精子发生中成千上万的分子变化,而这些关键分子的精确表达对于维持精子发生至关重要。然而,目前关于奶山羊精子发生的关键分子特征尚不清楚。此外,利用性控精液进行人工授精是快速扩繁高产奶山羊的有效途径,但性控精液在奶山羊方面仍有待进一步研究。因此,本研究以关中奶山羊为试验对象,利用免疫组织化学染色和组织观察法解析了奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞的发育规律,并通过转录组学测序技术对精子发生潜在关键分子进行挖掘,在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究主要获得以下结果:1.采集8组不同日龄（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d、180 d和240 d）的奶山羊睾丸组织,利用免疫组织化学染色和组织形态学观察,对雄性生殖细胞和支持细胞发育规律进行探究。结果表明:（1）奶山羊曲细精管直径随着睾丸发育而持续增加,且在75～90 d增长速度最快,在90 d时初次出现曲细精管管腔、圆形精子细胞和少量精子,提示奶山羊已经进入初情期。在180 d观察到大量精子,提示奶山羊已经进入性成熟阶段;（2）性原细胞在75 d前彻底转化为未分化精原细胞,未分化精原细胞在30 d启动分化,而在75～90 d未分化精原细胞增殖状态较为活跃,提示生精过程被激活;（3）SOX9和AMH均可作为奶山羊睾丸支持细胞的分子标记物,且AMH仅在未成熟的支持细胞中表达。支持细胞的增殖状态在45 d较为活跃,90 d后发育成熟。2.利用RNA-seq技术对奶山羊性成熟前（45 d）和性成熟后（240 d）的曲细精管组织进行转录组测序,挖掘并分析精子发生的关键lnc RNA和m RNA。结果表明:（1）在曲细精管组织中鉴定到11612个lnc RNA和18217个m RNA,其中性成熟前后差异表达lnc RNA和m RNA分别为7594和11986个;（2）挖掘出229个潜在精子发生关键m RNA,在性成熟后曲细精管样本中挖掘出KIT、DMRT1和SOX9等42个下调基因,DDX4、SYCP1和SYCP3等187个上调基因,发现PI3K/Akt、MAPK、AMPK、Ras和Rap1等信号通路可能调控精子发生;（3）在lnc RNA-m RNA互作网络发现TCONS＿00029023、TCONS＿00035144、TCONS＿00017872、TCONS＿00051085和TCONS＿00033882及其靶基因GSKIP、KAT8、MBD3L1、NANOS3和PRM3等关键分子可能参与调控奶山羊精子发生。3.采用单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing,sc RNA-seq）技术对出生后45 d、90 d和180 d的奶山羊曲细精管单细胞悬液进行测序,从单细胞水平系统解析精子发生的关键分子特征。结果表明:（1）捕获了来自3个不同日龄曲细精管的25373个细胞,成功鉴定精子发生过程所包含的精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、支持细胞、间质细胞、巨噬细胞、内皮细胞等细胞类型及其在不同日龄的细胞数量占比;（2）挖掘出一批潜在的睾丸生殖细胞及体细胞标记基因,例如在精原细胞高表达SOHLH1、PAGE4和DMRT1,精母细胞高表达YBX2、HSPB9和LYPD4,圆形精子细胞高表达PRM2、SPEM1和PRSS37,支持细胞高表达AMH、INHA和EGR1,间质细胞高表达INSL3、ACTA2和STAR等,解析了睾丸体细胞与生殖细胞相互作用的关键信号通路（睾酮、维甲酸、PDGF、FGF和WNT通路等）及其分子特征;（3）通过Monocles算法对9个生殖细胞亚群进行拟时序分化轨迹分析,揭示了生殖细胞分化过程中精原细胞、精母细胞以及圆形精子细胞的关键分子特征,例如DMRT1、TOP2A和TNP1等,成功构建了奶山羊精子发生单细胞转录图谱。4.利用RNA-seq数据对奶山羊性染色体编码基因进行注释,挖掘性染色体关键分子并进行性控精液研究。结果表明:（1）在奶山羊性染色体上鉴定出ABCB7、ABCD1和ACE2等500个X染色体编码基因,以及SRY、USP9Y和UTY等9个Y染色体编码基因,挖掘出TLR7和TLR8等19个X染色体编码受体基因;（2）通过免疫组织化学染色发现TLR7/8蛋白在睾丸圆形精子细胞、附睾精子和成熟精子中均有表达,且TLR7/8阳性精子占比接近50%;（3）TLR7/8蛋白在奶山羊X精子尾部特异表达,激活TLR7/8信号通路后可通过GSK3α/β-己糖激酶途径降低X精子的线粒体活性和ATP水平,最终导致X精子运动能力下降;（4）利用分选所得X精子进行体外受精,获得雌性胚胎比例为80.52%±6.75%,雄性胚胎比例为19.48%±6.75%。综上所述,本研究在从组织学层面解析奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞发育规律的基础上,利用RNA-seq和sc RNA-seq技术对奶山羊精子发生关键分子进行挖掘与分析,明确了雄性生殖细胞与支持细胞发育的关键时间节点,筛选出一批精子发生潜在关键基因和lnc RNA,鉴定了睾丸曲细精管的主要细胞类型并解析其关键分子特征,成功构建了奶山羊精子发生的单细胞转录图谱。此外,利用RNA-seq测序数据注释出X染色体和Y染色体编码的关键基因,并在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究将为奶山羊的分子育种和性控精液研究提供新的科学依据,同时为哺乳动物精子发生和雄性不育等相关研究提供理论参考。