中性纤维素酶产生菌的筛选及发酵条件初步优化

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中性纤维素酶因其最适pH在6.0~8.0之间,使得其在纺织和印染等领域有重要的应用前景和市场潜力,特别是对于中国这样一个纺织大国,随着中性纤维素酶在纺织业上应用的日益广泛,市场上对其有着旺盛的需求。但目前国内市场上的中性纤维素酶主要来源于进口,因此对中性纤维素酶的相关研究具有深远意义。本论文从土壤中分离筛选到一株产中性纤维素酶的细菌,为提高该菌株发酵产酶能力,一方面对其发酵产酶条件进行初步优化,另一方面利用传统诱变育种手段,以筛选正突变的菌株。通过富集培养、刚果红平板水解圈法初筛、牛津杯平板复筛、摇瓶复筛,从校园周边土壤中筛到一株产中性纤维素酶的细菌JN-D2,然后测定不同pH条件下的酶活,确定其所产纤维素酶为中性纤维素酶。经革兰氏染色、芽孢染色和菌落形态观察,发现该菌株为能形成芽孢的革兰氏阳性菌,进一步通过16S rDNA分子生物学鉴定,初步确定其为芽孢杆菌属。对菌株JN-D2发酵产酶的培养基进行优化。首先通过单因素实验确定了最优碳氮源分别为麦芽糖和酵母粉-蛋白胨混合氮源(混合质量比1:4);然后通过部分因子实验在4种无机盐(MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O)和麦芽糖、混合氮源这6个因素中发现对产酶有显著影响的因素是麦芽糖和混合氮源;再分别用响应面分析法和人工神经网络-遗传算法确定麦芽糖和混合氮源的最优浓度,发现两种优化方法结果高度相似,其中响应面优化得到的最优培养基碳氮源组合为麦芽糖1.97%、混合氮源2.03%,对应的酶活达到194.23U·mL-1,较爬坡实验前提高约49.0%;人工神经网络-遗传算法优化得到的最优培养基碳氮源组合为麦芽糖1.94%、混合氮源2.02%,对应的酶活达到193.40U·mL-1。。对菌株JN-D2摇瓶发酵产酶的培养条件进行优化。通过单因素实验考察培养时间、培养基初始pH、接种量、培养温度及装液量对产酶的影响,发现当培养基初始pH和接种量分别为6.0~8.0和0.4%~10%时对产酶影响非常小,选取最优培养基初始pH和接种量分别为培养基自然pH和2%,产酶最优培养温度、培养时间和装液量分别为30℃、48h和20mL。以菌株JN-D2为出发菌株,进行传统诱变育种,以提高其产酶能力。通过常压室温等离子体和紫外线诱变处理,采用基于多孔培养板的筛选方法,筛到一株较出发菌株酶活提高约20%的突变株JN-D2AU18。
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