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研究背景据世界卫生组织(world health organization,WHO)报道,全球约20亿人曾感染(hepatitis B virus,HBV),其中2.4亿人为慢性HBV感染者[1],每年约有65万人死于HBV感染所导致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等并发症[2]。2014年中国疾病预防控制中心(the Chinese center for disease control and prevention,CDC)对我国 30 岁以下人群的HBV血清流行病学调查结果显示,1～4岁、5～14岁和15～29岁人群的乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)检出率分别为 0.32%、0.94%和 4.38%[3]。慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B viral hepatitis,CHB)是由 HBV通过血液传播、母婴垂直传播和性传播等途径感染人体而引发的肝脏疾病[4]。欧洲肝病研究学会(the European society for the study of liver diseases,EASL)和美国肝病研究学会(the American society for the study of liver diseases,AASLD)等各大国际性CHB防治指南将乙型肝炎病毒E抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)血清学转换作为HBeAg 阳性CHB患者抗病毒治疗的停药标准之一[5-7]。CD8+T细胞定位在二级淋巴器官活化的T细胞区分化为效应细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTLs)清除感染的细胞[8]。与此同时,CD4+T细胞在B细胞滤泡中分化成滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells,Tfh)促进保护性抗体的产生[9]。在慢性病毒感染中,病毒特异性CD8+T细胞呈现耗竭状态,其效应功能较差,分化为记忆细胞的潜力变弱[10-13]。然而,耗竭的CD8+T细胞在慢性感染中[14-18]仍然可以控制病毒复制,目前机制未明。慢性感染过程中耗竭的CD8+T细胞表达趋化因子受体5(chemokine receptor 5,CXCR5)进入B淋巴滤泡中清除病毒感染的Tfh细胞和B细胞,将这群细胞称之为“滤泡细胞毒性T细胞(follicular cytotoxic T cells,Tfc)”[19]。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)持续感染Tfh细胞,EB病毒(epstein-barr virus,EBV)持续感染B细胞[20-25]。HIV和小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choroid plexus virus meningitis,LCMV)慢性感染中,CXCR5+CD8+T细胞分布在B淋巴滤泡中,低表达抑制性受体具有很强的细胞毒性,比起CXCR5-亚群[26]。慢性病毒感染和肿瘤患者体内T细胞均处于耗竭状态[27-29]然而CXCR5+CD8+T细胞在HBV感染中的作用目前尚未有报道。HBV基因转入小鼠模型是利用小鼠尾静脉高压水动力转染法注射含HBV基因的载体,或者注射含HBV基因的嗜肝性病毒载体的一种模型[30-31]。研究目的利用慢性HBV感染横向和纵向队列以及HBV动物模型,探究CXCR5+CD8+T细胞在HBV感染过程中的特点。研究方法1.流式细胞术(flow cytometry,FCM)研究初治CHB和抗病毒患者外周血CXCR5+CD8+T细胞的频数特点。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测HBV患者肝内CXCL13表达,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测 ALT 水平;2.磁珠分选HBeAg 阳性初治CHB患者的外周血CD8+T细胞,FCM检测CD8+T细胞CXCR5表达水平、表型和功能情况;3.FCM检测HBV小鼠外周血、脾、肝内CXCR5+CD8+T细胞的频数、表型和功能;4.统计分析符合双侧假设检验,以α=0.050为检验水准,P<0.050具有统计学意义。结果1.初治CHB中,慢性HBV感染患者外周血CXCR5+CD8+T细胞频数较健康志愿者(healthy controls,HC)组升高(P<0.050),替比夫定抗病毒队列中,完全应答组(complete response group,CR)组患者外周血CXCR5+CD8+T细胞频数在0周、24周、48周均显著高于非完全应答组(non-complete response group,NCR)组(P=0.001;P=0.021;P=0.009);2.qPCR定量检测发现HBV患者肝内CXCL13表达较健康志愿者升高(P<0.050)并且与血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)成正相关;3.CXCR5+CD8+T细胞相比较传统的CD8+T细胞和CXCR5-CD8+T细胞高表达 CD38、CD69 和 HLADR(P<0.050;P<0.050;P<0.050)高分泌 IFN-γ和白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)(P<0.050;P<0.050),低分泌 Granzyme B,杀伤作用较弱(P<0.050;P<0.050);4.与健康志愿者相比,慢性HBV感染者CXCR5+CD8+T细胞高表达PD1、CTLA4、HLADR,低表达 CD38(P<0.050;P<0.050;P<0.050;P<0.050);分泌更多的Granzyme B、IL-21,但分泌IFN-γ减少(P<0.050;P<0.050;P<0.050);5.IL-21促进健康志愿者和慢性HBV感染者CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ分泌,另外,抑制健康志愿者中PD1表达(P<0.050;P<0.050;P<0.050),anti-PD1也可以促进CXCR5+CD8+T细胞IFN-γ分泌(P<0.050)。6.HBV小鼠脾内CXCR5+CD8+T的频数显著性高于外周血和肝内(P<0.010;P<0.050)。结论CXCR5+CD8+T细胞在慢性HBV感染中发挥重要抗病毒作用。