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目的 观察外源过氧化氢酶基因在晶体上皮细胞中高表达对氧化损伤所致的晶体上皮细胞凋亡的影响，探讨晶体上皮细胞凋亡的机制及过氧化氢酶基因重组腺病毒用于白内障基因治疗的可行性。 方法 1．将人晶体上皮细胞系SRA01／04细胞复苏后使用DMEM培养液，15％优等胎牛血清，37℃，5％二氧化碳进行培养，待细胞生长至一定数目，将其分为三组：实验组，空载体组，对照组。 2．克隆过氧化氢酶基因编码区：以扩增cDNA克隆菌体纯化的质粒为模板，按过氧化氢酶基因全长cDNA序列设计过氧化氢酶基因编码区引物，行RT-PCR。产物与pGEM-T Easy T-A克隆载体进行连接。连接产物转化JM109感受态菌。蓝白筛选、菌落PCR验证，筛选出阳性克隆，标记为pGEM-T／CAT。扩增菌体，纯化质粒，进行DNA序列分析。 3．构建过氧化氢酶基因pIRESneo3表达载体：以纯化的pGEM-T／CAT质粒为模板，用序列为5’-gggatatcgctatggctgacagccgggat-3’和5’-gggatatcgcctcacagatttgcttct-3’的引物进行PCR扩增。回收扩增出的片段。经EcoRV和EcoR Ⅰ双酶切后，与经同样双酶切的pIRESneo3载体，在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化大肠杆菌DH5α。使用卡那霉素筛选、菌落PCR和EcoR Ⅴ、EcoR Ⅰ双酶切确定阳性克隆。扩增阳性克隆，使用QIAGEN Midi质粒纯化试剂盒纯化pIRESneo3／CAT质粒，OD260／280测定浓度与纯度，调整浓度为1μg／μl贮存，以备转染用。 4．利用质脂体转染法分别将pIRESneo3-CAT重组质粒及pIRESneo3空载体转染入晶体上皮细胞SRA01／04中。 5．测定SRA01／04细胞G418耐受浓度，并用该浓度G418选择性培养液筛选稳定表达克隆。 6．用过氧化氢处理三组细胞，MTT方法测定过氧化氢对晶体上皮细胞的半数致死量。 7.流式细胞术、Ao/EB染色法分析过氧化氢诱导晶体上皮细胞凋亡作用。 8.免疫组化方法分析细胞色素C在活性氧诱导晶体上皮细胞凋亡过程中在细胞内的分布。 9.Westem印迹方法分析晶体上皮细胞凋亡过程中casPase一的活化。 1 0.使用Adeno一X ExPression System构建过氧化氢酶基因重组腺病毒，用HEK 293细胞进行噬斑形成实验（Plaque Assay）测定病毒贮存液滴度。 11.取大鼠晶体放人24孔培养板，加人含青霉素和链霉素各10万U/L的ro%胎牛血清DMEM培养基，置37℃，5%CO:培养箱中培养shr，取透明晶体备用。 12.使用浓度为6 x lo7p似耐的重组腺病毒感染培养晶体，以3hr为间隔，制备晶体上皮细胞单细胞悬液，定量Westem印迹分析测定过氧化氢酶表达峰值时间。 1 3.按随机分组原则将大鼠晶体分为对照组，过氧化氢处理组，过氧化氢及重组腺病毒处理组，各组分别加含青霉素和链霉素各10万U/L的10%胎牛血清DMEM培养基和/或100卜m心L H20:和/或100卿心L HZOZ+6 x 10，p何时重组腺病毒，分别于处理后6hr、12hr、18hr、抖hr使用透射光源在OLYMPUS光学显微镜下观察并照相。用MetaM0rph图像分析软件进行晶体透明度分析，用Anne石nV一nTc凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡分析。 14.数据处理:实验结果以均数士标准差（又土s）表示，组间比较采用方差检验。实验结果 1.获得了过氧化氢酶高表达晶体上皮细胞SRA01/04一CAT，其过氧化氢酶的表达水平是SRA01/04细胞的3.5倍。SRA01/04一CAT细胞的过氧化氢酶活性是SRA01/04细胞过氧化氢酶活性的2.2倍。 2.过氧化氢对SRA01/04细胞的Ic50是32.24林M，对SRA01/04一CAT的Ic50是85 .32卜M，转染过氧化氢酶基因后sRAol/04细胞对过氧化氢的耐受能力提高2.65倍。 3.过氧化氢诱导晶体上皮细胞凋亡的过程伴随细胞色素C的释放和c邓pase一的激活。转染过氧化氢酶基因后细胞色素C的释放和capase-3的激活均受到抑制，细胞凋亡数减少。 4.构建出有生物学活性的过氧化氢酶基因重组腺病毒，噬斑形成实验测定重组病毒贮存液滴度为4 xro’Zp似血。 5.重组腺病毒感染体外培养大鼠晶体后ghr过氧化氢酶表达达到峰值，并持续整个实验时间。 6.加人过氧化氢处理6hr、12hr、18hr、24hr后，过氧化氢及重组腺病毒处理组晶体透明度低于对照组，高于过氧化氢处理组，三组差异有显著意义（P<0.05）。过氧化氢处理6hr、12hr、18hr、24hr后，过氧化氢及重组腺病毒处理组细胞凋亡率高于对照组，低于过氧化氢处理组，三组差异有显著意义（P<0 .05）。结论 1.线粒体功能损伤是活性氧诱导晶体上皮细胞凋亡的原因，提高晶体上皮细胞活性氧清除能力能够抑制活性氧诱导产生的晶体上皮细胞凋亡。 2.外源过氧化氢酶基因能够在晶体上皮细胞中稳定表达并使晶体上皮细胞的抗氧化能力提高，抑制活性氧诱导产生的晶体上皮细胞凋亡，进而可减少因晶体上皮细胞凋亡导致的白内障的发生。 3.过氧化氢酶基因重组腺病毒可以有效地缓解由过氧化氢导致的晶体上皮细胞凋亡和晶体混浊的发生。过氧化氢酶基因重组腺病毒可以用于氧化性白内障的基因治疗。