目的：　　肠三叶因子TFF3主要表达在胃肠道上皮，由杯状细胞分泌，其主要生理作用是保护和重建肠道上皮，维持肠上皮细胞屏障的完整性。在胃肠道组织发生慢性炎症时，TFF3异常表达。新近发现，TFF3与肿瘤有一定关系，它能够促进细胞迁移，与结肠癌细胞生长，细胞间粘连破坏，肿瘤细胞的侵润及转移相关。体外实验和动物实验表明，IL-10在炎症、恶性肿瘤和自身免疫性疾病均发挥重要作用。但在肠组织中TFF3和IL-10的关系尚不清楚。我们报道了TFF3能诱导MEK表达，而文献提示ERK通路的活化与IL-10的表达有密切的关系，因此，我们推测TFF3可能参与IL-10调节，并且在炎症相关的肿瘤中起着重要作用。我们小组前期研究发现TFF3能够上调Twist表达，受到国际业界专家的专章评论文章的高度认可，近期，Dr.Dafna在Cancer Cell将我们TFF3-Twist信号归纳为重要的Twist介导的肿瘤信号通路之一。Twist是一种碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子，目前已在多种人类上皮来源肿瘤中发现Twist高表达，同时研究认为Twist是一种癌基因，能够编码凋亡抑制蛋白，与EMT及恶性肿瘤生长、侵袭、转移和细胞凋亡密切相关。Twist作为白介素的转录因子p65的负调节子，是否参与TFF3介导的IL调节尚不清楚。我们的研究中还发现ARR2受到TFF3调节，ARR2有一个核输出信号(NES)，游离的ARR2被细胞核排除，但是否ARR2参与TFF3诱导的IL-10及其具体机制并不清楚。本研究意在探讨TFF3通过ARR2/ERK/Twist通路调节IL-10这一过程的具体机制，为炎症相关肿瘤的研究提供新证据。　　方法：　　一、构建实验相关表达载体及稳转细胞系　　1、分子克隆技术构建实验相关表达载体。　　2、慢病毒感染IEC细胞建立过表达TFF3及干扰Twist稳转细胞系。　　二、验证Twist介导TFF3调节IL-10的表达　　1、RT-PCR和Western Blot方法验证TFF3调节IL-10表达。　　2、结合RNA干扰技术，RT-PCR和Western Blot方法验证Twist在转录、翻译水平调节IL-10表达作用。　　3、ELISA技术检测Twist介导的TFF3调节IL-10的分泌水平。　　三、确认TFF3通过ERK1/2调节Twist表达　　1、Western Blot分析检测高表达TFF3的瞬时转染细胞及稳转细胞中，ERK1/2磷酸化水平的变化。　　2、激光扫描共聚焦技术结合Western Blot检测TFF3诱导p-ERK1/2核质异位。　　3、RNA干扰技术验证TFF3通过ERK1/2调节Twist表达。　　4、免疫共沉淀技术检测TFF3调节ERK1/2与Twist相互作用。　　四、检测ARR2参与调节p-ERK1/2与Twist的互作关系　　1、免疫共沉淀方法检测高表达TFF3情况下ARR2与p-ERK1/2的相互作用。　　2、免疫共沉淀方法检测ARR2调节p-ERK1/2与Twist的相互作用。　　3、激光扫描共聚焦技术结合Western Blot检测ARR2诱导p-ERK1/2核质异位。　　五、验证Twist负调节p-ERK1/2　　RNA干扰技术及Western Blot技术检测Twist对p-ERK1/2的负调节作用。　　结果：　　一、成功构建实验相关质粒及稳转细胞系。　　1、成功构建真核表达载体pEGFP-N1-TFF3、pcDNA3.1/HisA-Tab1、pcDNA3.0/Flag-ERK1、pcDNA3.0/Flag-ERK2、pEGFP-N1-ERK1、pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ERK1、pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ARR1、 pSIREN-RetroQ-ZsGreen-ARR2及原核表达载体pGEX-5x-1-ARR2。　　2、成功建立慢病毒介导的过表达TFF3稳转细胞系及干扰Twist稳转细胞系。　　二、证实Twist介导TFF3调节IL-10的表达　　1、TFF3在转录和翻译水平上调IL-10表达。　　2、Twist在转录及翻译水平上调IL-10表达并在干扰Twist后IL-10表达减少。　　3、ELISA实验证实TFF3通过Twist调节IL-10的分泌。　　三、明确TFF3通过ERK1/2调节Twist表达　　1、高表达TFF3使ERK1/2磷酸化水平增强。　　2、TFF3诱导p-ERK1/2出核。　　3、TFF3通过ERK1/2调节Twist表达。　　4、高表达TFF3，ERK1/2与Twist相互作用减弱。　　四、确认ARR2参与调节p-ERK1/2与Twist的互作关系　　1、高表达TFF3增强，ARR2与p-ERK1/2的相互作用。　　2、ARR2调节p-ERK1/2与Twist的相互作用减弱。　　3、ARR2诱导p-ERK1/2出核。　　五、发现IEC细胞中Twist负性调节p-ERK1/2表达　　结论：　　Twist介导TFF3调节IL-10的转译及分泌表达。ERK1/2被证实是TFF3上调Twist表达的关键分子，在细胞核内结合并抑制Twist表达;ARR2参与TFF3诱导p-ERK1/2出核，进而解除对Twist的抑制作用，从而上调IL-10。