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研究背景癌症是世界范围内疾病死亡的重要原因,目前我国肺癌患者的死亡率占癌症死亡率之首。传统的治疗手段包括手术、化疗及放疗等在内的综合治疗,但都没有很好的治疗效果。肺癌容易早期远处转移、对放化疗不敏感等因素是治疗中的关键难题。研究证实免疫逃逸机制是肿瘤在人体内的发病原因之一,针对免疫逃逸的靶向治疗也可能成为攻克恶性肿瘤最有效的手段。诱导机体免疫细胞凋亡是肿瘤免疫逃逸的一种方式,在肿瘤微环境中的肿瘤细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)相互作用,导致TIL发生凋亡,已经证实Fas及其配体(FasL, Fas ligand)介导的受体凋亡途径参与并促进了这一过程。Fas、FasL、FADD及caspase-8是Fas/FasL介导的细胞凋亡过程中的核心成员,在细胞凋亡过程中具有十分重要的作用;同时有研究结果显示细胞核内磷酸化FADD(p-FADD)的高表达与肺癌的不良预后相关。由此可见,研究Fas/FasL机制中凋亡相关分子在肺癌细胞诱导TIL凋亡过程中的作用,将有利于寻找针对肺癌治疗的新靶标。研究目的本实验利用人T淋巴细胞株Jurkat作为活化的T细胞,设计以人肺腺癌细胞株A549诱导T细胞凋亡的细胞培养模型,研究肺腺癌细胞诱导T细胞凋亡时,Fas/FasL介导的受体凋亡途径中Fas、FasL、FADD及caspase-8等分子在T细胞中的表达变化情况,寻找针对肺癌免疫治疗的新方法。方法1.确定A549细胞及Jurkat细胞活性均在95%以上。将对数生长期A549细胞与对数生长期Jurkat细胞按数量比例(A549/Jurkat) 1:1, 10:1, 20:1, 50:1共培养6h,对照组Jurkat细胞只加入培养液培养;流式细胞术分别检测各组中Jurkat细胞凋亡率,确定A549细胞能成功诱导Jurkat细胞凋亡,并寻找最佳细胞作用比例。在此基础上将A549细胞与Jurkat细胞按数量比(A549/Jurkat)50:1共培养2h, 4h, 6h,对照组Jurkat细胞只加入培养液培养,流式细胞术分别检测各组中Jurkat细胞凋亡率,确定A549细胞诱导Jurkat细胞凋亡的最佳培养时间。2.将A549细胞与Jurkat细胞按细胞数50:1共培养6h,同时设只加RPMI-1640培养液的Jurkat细胞为对照组,采用RT-PCR及Western blotting分别检测各组Jurkat细胞表达Fas, FasL, caspase-8和FADD mRNA和蛋白表达情况,明确在A549细胞诱导Jurkat细胞凋亡过程中,Fas/FasL介导的受体凋亡途径中凋亡相关分子Fas, FasL, Caspase-8及FADD的作用。3.基于前面的实验结果,将A549细胞与Jurkat细胞按细胞数50:1共培养6h,并将加入caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK的另一组作为对照,流式细胞术检测两组中Jurkat细胞凋亡率,Western blotting检测两组Jurkat细胞中FADD及p-FADD蛋白表达情况,并采用激光共聚焦扫描荧光显微镜检测FADD及p-FADD蛋白在Jurkat细胞中的分布情况,从而明确caspase-8及其抑制剂Z-IETD-FMK在肺腺癌细胞免疫逃逸过程中的部分分子机制。结果1.人肺腺癌细胞株A549可以成功诱导人T淋巴细胞株Jurkat凋亡,随着A549细胞与Jurkat细胞数量比例从1:1逐渐增加到50:1,Jurkat细胞凋亡率呈显著升高趋势(P<0.01);同时,当A549细胞与Jurkat细胞以50:1共培养,作用时间由2h延长到6h后,Jurkat细胞凋亡率也显著增高(P<0.01),但2h组与4h组、4h组与6h组之间无显著差异(P>0.05)。2.与对照组比较,实验组Jurkat细胞表达caspase-8及FADD mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.01);表达Fas mRNA水平虽明显升高(P<0.05),但蛋白表达无显著变化(P>0.05);各组Jurkat细胞中FasL的mRNA和蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。3.人肺腺癌细胞株A549与Jurkat细胞以50:1共培养6h后,Jurkat细胞胞浆中FADD蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞核中p-FADD蛋白水平显著降低(P<0.01)。在加入80μM caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK的共培养体系中,Jurkat细胞凋亡率显著降低(P<0.01),但仍显著高于空白对照组(P<0.01); Jurkat细胞胞浆中FADD蛋白表达水平有所下降,细胞核中p-FADD蛋白表达水平有明显升高,但与空白对照组比较均仍有显著差异(P<0.01)。与对照组比较,只加入80μM caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK及培养液的Jurkat细胞凋亡率无显著差异,但Jurkat细胞胞浆中FADD表达显著降低,而细胞核中p-FADD表达则显著升高。结论1.随着肺腺癌细胞数量的逐渐增多以及作用时间的不断延长,T细胞凋亡率显著升高,表明人肺腺癌细胞株A549可以通过诱导活化T细胞凋亡达到自身免疫逃逸的目的,这一作用过程与肺腺癌细胞的数量及作用时间相关。2.人肺腺癌细胞株A549主要通过改变活化T细胞中caspase-8及FADD的表达水平,达到促进T细胞凋亡的目的,Fas及FasL在整个过程中也起重要作用,但其表达水平的变化并不显著。3. caspase-8在人肺腺癌细胞诱导T细胞凋亡过程中的作用十分关键,T细胞中FADD及p-FADD的表达受caspase-8水平的调控,但其作用并不是特异性的4.使用80μM的caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK可以在一定程度上阻断肺腺癌细胞株A549诱导T细胞凋亡,抑制肺腺癌细胞株A549免疫逃逸过程。其作用机制可能是降低活化T细胞胞浆中FADD的表达及升高细胞核中p-FADD的表达。