研究背景和目的一、研究背景：淋巴结是哺乳动物重要的免疫器官,淋巴通路是恶性肿瘤转移的重要途径,临床上判断淋巴结是否累及,是肿瘤分期、治疗方案选择、疾病预后判断的重要参考指标。淋巴结活检具有较大价值,但是进行淋巴结深部活检或临床治疗后复查常常比较困难,寻找一种简单、安全、无创的淋巴结检查方法受到广泛的重视。传统上,判断淋巴结的转移与否常采用测定淋巴结径线的方法,此方法作为常规计算机断层扫描(Computed Tomography, CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)对淋巴结的定性诊断价值仍有很大的争议。超声波检查淋巴结血管的变化在鉴别淋巴结的良恶性病变中具有一定的意义,但良恶性淋巴结的征象有较多的重叠,超声的诊断准确率偏低。X线淋巴结造影术方法复杂、费时,有一定的并发症,不能满意显示淋巴结细节等特点。正电子发射计算机体层扫描(Positron Emission Tomography, PET)/CT从分子代谢的角度判断淋巴结的转移情况,但分辨率低,且价格昂贵。采用对比剂增强的MR淋巴管成像是一种新型无创性的检测方法,目前使用最广泛、较理想的对比剂是超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron Oxide, SPIO)类对比剂,这是一种网状内皮系统被动靶向对比剂,能够在T2加权成像(T2-weighted Imaging, T2WT)序列上产生负性增强的作用。直径<30nm的SPIO称为超小超顺磁性氧化铁(Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide, USPIO),它的MRI增强扫描可以发现位于淋巴结内的局限性转移灶,而与淋巴结是否增大无关。但是USPIO是被淋巴结髓质的吞噬细胞吞噬而显像的,属于被动靶向方式,存在不少问题,可能会有假阴性、假阳性的发生,影响诊断的正确性。L-选择素(L-selectin)存在于正常的淋巴细胞表面上,其正常功能是作为淋巴细胞到达外周淋巴结归巢的受体。淋巴结的高内皮微静脉(High Endothelial Venules, HEV)内皮细胞上、迷路及髓质中,均有L-选择素配体的高度表达,L-选择素配体的核心抗原是MECA-79,其单抗具有与L-选择素相似的作用,能高度特异性与L-选择素配体高表达区结合,已有文献表明抗MECA-79单抗修饰的超声对比剂可以主动靶向正常淋巴结；聚氰基丙烯酸正丁酯(Polybutylcyanoacrylate, PBCA)以安全无毒、生物相容性好等特点成为目前最受重视的药物载体,那么PBCA经此抗体修饰以后,以它为载体携带超顺磁性物质(比如USPIO)可以制成MR对比剂,这种MR增强扫描应该可以实现主动靶向淋巴结,据我们己知的文献尚未见类似报道。二、研究目的：1、在弱酸性的条件下,将USPIO颗粒包被在PBCA纳米球内部,碱性条件下处理之后自动生成羧基,USPIO-PBCA经交联剂与链霉亲和素反应,再与生物素化MECA-79单抗,通过生物素-亲和素系统修饰到USPIO-PBCA纳米微粒外壳上,从而制备L-选择素配体靶向性的USPIO-PBCA纳米微粒；2、动物体外实验,将生物素化MECA-79单抗在正常兔的新鲜淋巴结上做免疫组化实验检测该抗体的特异性靶向能力；3、正常新西兰大白兔活体动物实验,将制备出的抗MECA-79-USPIO-PBCA纳米微粒通过足背组织间隙注射的方式做MRI增强扫描,在不同时间点检测对正常兔胭窝淋巴结的定性强化效果,病理检查证实。方法一、制备与表征1、USPIO-PBCA纳米微粒的制备及检测将氰基丙烯酸正丁酯(Butylcyanoacrylate, BCA)单体用CH2-Cl2稀释(VCH2Cl2:VBCA=3:1),配备酸性条件(pH6.4)的缓冲溶液(KH2PO4-NaOH)50ml,在溶液中融入浓度约为5%非离子表面活性剂Dextran-70,将浓度为11.2mg/ml的USPIO滴加入混合溶液中,搅拌5min,搅拌速率为800rpm。加大搅拌速率至1200rpm,缓慢逐滴滴加1.2%BCA单体入混合液中,持续乳化聚合5h,终止反应后减压抽滤,即得PBCA磁性纳米球稳定混悬液。随后用0.45μm微孔滤膜过滤,将滤液存于4℃冰箱内备用。Malvern-3000HS激光粒度分析仪测纳米微粒的粒径和分布：取上述USPIO-PBCA混合液透析48h,除去游离的USPIO、Dextran-70,取透析过的USPIO-PBCA溶液用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布。透射电镜观察纳米微粒的形态：取少量上述经透析过USPIO-PBCA,在透射电镜下观察USPIO-PBCA大体形态。振动样品磁强计检测微粒的磁学特性：在室温下,将约0.5mg冻干粉状USPIO-PBCA纳米微粒装入直径1cm的试管,密封后置入振动样品磁强计,逐渐加大磁场强度,并从显示屏观察磁化曲线,直到样品的磁化强度不再增加为止,记录磁化曲线。磁共振扫描测T2时间及T2弛豫率：取USPIO-PBCA溶液适量,分别加水稀释至铁浓度为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mmol/L,在MR机器(3.0T,美国GE公司,Signa EXCIT HD)上扫描,采用8通道头部线圈,层厚3.0mm,间隔0.5mm,扫描序列采用T2map:重复时间(Time of Repetiton,TR)3000ms,回波时间(Time of Echo,TE)20ms、40ms、60ms、80ms,均做冠状位扫描。测定T2值：将原始数据导入ADW4.3工作站,测量USPIO-PBCA的T2弛豫时间值。计算USPIO-PBCA T2弛豫率：T2弛豫率定义为含铁浓度与1/T2直线方程的斜率。2、链霉亲和素连接USPIO-PBCA微粒及检测将获得的初始USPIO-PBCA在碱性条件下(pH=9)作用一个小时,使其表面产生羧基基团；用灭菌磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)将USPIO-PBCA稀释至含铁量为0.52μM/ml,,将含1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(1-ehy1-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC)的PBS溶液加入其中,调整溶液pH至7.0,然后加入链霉亲和素的PBS溶液,4℃反应过夜,得到链霉亲和素标记的USPIO-PBCA纳米微粒。反应摩尔比：USPIO-PBCA:链霉亲和素：EDC为1：10：25(EDC浓度在0.15g/L最佳)。用生物素化的生物素-异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyanate, FITC)与链霉亲和素化的USPIO-PBCA纳米微粒反应,用荧光显微镜观察荧光程度来评价链霉亲和素是否成功接到USPIO-PBCA纳米微粒外壳上用滴定法将生物素化的FITC逐滴滴加在链霉亲和素化的USPIO-PBCA溶液里,采用流式细胞仪观察荧光峰的移动情况。3、链霉亲和素标记的USPIO-PBCA与生物素化MECA-79单抗的链接加入5μg的对应生物素化的MECA-79单抗在含有107链霉亲和素标记的USPIO-PBCA的混悬液中,孵育10min,即可得抗MECA-79-USPIO-PBCA纳米微粒。4、MECA-79单抗标记的USPIO-PBCA微粒理化特性的测定投射电子显微镜观察已制备纳米微粒的表观形态特征,粒度测定测试MECA-79单抗标记的USPIO-PBCA纳米微粒的分布、粒径。二、MECA-79单抗在正常兔新鲜淋巴结的靶向性实验实验分组方法：1)、实验组：生物素化的MECA-79单抗；2)、对照组：另外一种生物素化的同源性IgM。分别作免疫组化,观察抗体的靶向性情况。选用正常的新西兰大白兔3只,麻醉后每只动物取双侧胭窝淋巴结各1枚,一共6枚,预冷的生理盐水反复漂洗3-5次,漂净血水,吸水滤纸吸干水分,将新鲜的正常淋巴结立刻放入-70℃快速冷冻,丙酮固定,行冰冻切片,片厚8μm,非特异的结合点先用5%(0.1mol/L PBS配制)山羊血清白蛋白进行封闭(37℃,孵育.1小时,立即用PBS漂洗过夜,4℃)；室温下,切片放在含1%生物素化单抗的山羊血清白蛋白(1：100)孵育1小时,再用3%的H2O2(0.1mol/LPBS配制)处理30min,以封闭内源性的辣根过氧化物酶的活性；然后O.1mol/LPBS漂洗3x5min,再滴加一种外源性的亲和素性过氧化物酶孵育1h,显微镜下观察显色情况。三、MECA-79单抗标记的USPIO-PBCA纳米微粒对正常兔淋巴结的靶向性成像研究1、实验分组：将18只正常新西兰大白兔随机分为三组,每组6只。1)靶向组：正常新西兰大白兔,经一侧足趾间隙注射含Fe15μmol的抗MECA-79-USPIO-PBCA对比剂；2)对照组1：正常新西兰大白兔,经一侧足趾间隙注射含Fe15μmol的USPIO-PBCA对比剂；3)对照组2：正常新西兰大白兔,经一侧足趾间隙注射含Fe15μmol的USPIO对比剂。2、实验步骤：1)麻醉：3%戊巴比妥钠(20mg/Kg)经耳缘静脉给药,酌情添加少量安定,麻醉动物。2)固定：以仰卧位的方式将动物固定在一合适木板上,左右尽量对称。3、扫描设备及参数1)扫描设备：GE Signa Excite3.0T MR磁共振成像系统,采用膝关节线圈。2)扫描序列及参数：冠状位、矢状位T2WI(TR/TE:5000/85ms,回波链(Echo Train Length, ETL):16,层厚：2mm,视野(Field of View, FOV):12cm,扫描矩阵：256×256,重复次数：3)；冠状位、矢状位T2WI,2D梯度回波T2*加权成像(T2*-Weighted Imaging,T2*WI)(TR/TE:400/24ms,反转角：20-,层厚：2mm, FOV:12cm,扫描矩阵：256×256,脉冲重复激发次数(Number of Excitations, NEX):2);矢状位、横断位T1加权成像(T1-Weighted Imaging,T1WI)自旋回波序列(TR/TE:400/12ms,层厚：2mm, FOV:12cm,扫描矩阵：256×256, NEX：2),以上序列需要平扫及增强扫描。3)对比剂增强扫描方式：向兔的一侧足趾间隙局部注射对比剂(一侧肢体注射总容量0.2m1),注射后1,2,8,12,24,48h分别成像。MR扫描完成后,将数据传至后处理工作站,进行后续的MRI图像分析。4、数据处理分别测定注射对比剂侧的淋巴结信号强度、肌肉组织信号强度,在背景区域选取较大的ROI,测背景噪声的标准差。计算各组淋巴结的信噪比。5、统计学分析采用SPSS13.0软件包,采用重复测量的方差分析(统计方法：Bonferroni)对比增强前后各组淋巴结及肌肉组织信噪比(Signal to Noise Ratio, SNR)是否有显著性差异。用单因素方差分析(统计方法：Bonferroni)分析组间不同时间点淋巴结及肌肉组织SNR是否有显著性差异,P<0.05认为有显著性差异。6、病理学检查所有实验动物在完成MRI增强扫描后,用耳缘静脉注入空气法处死动物,取出胭窝淋巴结,然后用10-15%中性福尔马林浸泡、固定,常规石蜡包埋、切片,片厚1.5μm,行普鲁士蓝染色(Prussion Blue Staining),分别观察实验组、对照组1和对照组2淋巴结组织常规光镜下的形态及组织内含Fe的情况,与影像学表现进行对照分析。结果一、用Malvern-3000HS激光粒度仪测定的USPIO-PBCA平均粒径约为159nm,多分散系数为0.23。二、透射电镜下观察USPIO-PBCA纳米微粒呈球形、类球形,分布较均匀,表面光滑、平整,粒子之间无粘连,粒子平均粒径大小约为60-70nm,提示制备出了小粒径、高稳定性的USPIO-PBCA纳米颗粒。三、振动样品磁强计磁学特性测试结果显示制备出的USPIO-PBCA纳米颗粒具有超顺磁性。四、经磁共振T2弛豫时间扫描,随着铁浓度的增加,USPIO-PBCA的T2值逐渐下降,所得样品的T2弛豫率0.156x106mol-1.s-1。五、荧光显微镜和流式细胞仪检测结果,均提示USPIO-PBCA已经成功链霉亲和素化,并且具备与生物素化的单抗反应活性。六、扫描电子显微镜观察已制备纳米微粒的表观形态特征,显示纳米微粒成球规整,呈圆形或者椭圆形,分布均匀,彼此不粘连,粒径约80nm。粒度测定显示粒度分布均匀,粒径约220.3nm,分散系数为0.318。七、正常兔新鲜淋巴结辣根过氧化物酶免疫组化结果显示,靶向组MECA-79单抗对正常淋巴结有特异性染色,对照组普通IgM单抗则没有特异性染色。八、磁共振扫描正常兔胭窝淋巴结和SPSS统计学分析结果显示,在T2*WI、T2WI序列上,靶向实验组的淋巴结SNR降低低于对照组1和对照组2淋巴结,差异有统计学意义,同一组间不同时间点差异也有统计学意义,不同组间和不同时间点有交互效应；在T1WI序列上,三组淋巴结的SNR差异有统计学意义,不同时间点差异也有统计学意义,不同组间和时间点无交互效应；三组肌肉组织SNR在T2*WI、T2WI、T1WI序列上,不同组间及组内不同时间点差异无统计学意义。九、病理检查普鲁士蓝染色结果显示,靶向组注射侧的兔淋巴结内含有较多蓝染的铁颗粒,分布范围较广,对照组两组内蓝染的铁颗粒相对较少,且主要局限于淋巴结的髓质内。结论一、在弱酸性条件下,成功制备出具有超顺磁性的抗MECA-79-USPIO-P BCA靶向性纳米微粒,粒子大小较均匀,表面光滑、平整,为后续动物实验打下基础。二、MECA-79单抗可以特异性靶向兔的正常淋巴结的副皮质区,可以间接说明制备出的抗MECA-79-USPIO-PBCA纳米微粒可以特异性靶向兔正常淋巴结。三、动物活体实验表明,抗MECA-79-USPIO-PBCA纳米微粒对正常淋巴结具有特异靶向性,可以使正常淋巴结在T2*WI、T2WI、T1WI上SNR降低；而且对照实验表明靶向组的负性强化作用要明显强于两组对照组,普鲁士蓝染色结果显示靶向组的淋巴结内蓝染的铁颗粒较多,而且范围更广,说明制备出的抗MECA-79-USPIO-PBCA纳米微粒不仅能够被单核-吞噬系统所吞噬,而且能够主动靶向淋巴结的副皮质区。