论文部分内容阅读
作为固着生活的有机体,植物经常受到逆境如病虫害、低温、干旱以及高盐等生物和非生物胁迫。为了适应这些不利的生长环境,植物在长期的进化过程中形成了较为系统的应答保护机制。气孔是植物特有的结构,它在植物生长发育和逆境应答中扮演重要角色。干旱胁迫时,植物能通过关闭气孔减少水分的散失;当受到昆虫或病原菌侵害时,植物可通过关闭气孔阻止病原菌进入植物体内,同时产生防御信号形成植物免疫。研究表明,在植物应答干旱时,体内会合成大量的脱落酸(Abscisic acid,ABA)来促进气孔的关闭,以减少水分散失从而提高植物的抗旱性。目前这种依赖于ABA的抗旱途径已经得到了深入和系统的研究,ABA的受体及其信号成分也相继被克隆和功能分析。乙烯也是一种重要的植物激素,目前对它的研究多聚焦于衰老和植物发育的调控上,而其在干旱条件下的作用鲜有报道。不过,对于其在气孔行为的调节作用却存在两种截然相反的观点:促进和抑制气孔关闭。鉴于此,我们试图通过遗传学、生理学、生物化学及分子生物学技术来研究是否存在依赖于乙烯的抗旱途径,以及乙烯信号与ABA信号是否存在一定的交叉对话。本研究首先通过对乙烯合成突变体、乙烯信号转导相关突变体进行表型分析,在干旱胁迫下,和野生型Col-0相比,乙烯敏感突变体ebf1-1、ebf2-1、eto1失水较慢,干旱复水6 h后突变体能恢复正常的生长;而乙烯不敏感突变体ein2-5、ein3-1、etr1失水较快,萎蔫严重,干旱复水6 h不能恢复正常的生长。对ebf1-1、ein3-1表皮条气孔显微观察发现,和野生型Col-0相比,乙烯敏感突变体ebf1-1气孔几乎完全关闭,而乙烯不敏感突变体ein3-1气孔仍保持一定的张开状态。说明乙烯可以通过其信号途径促进气孔的关闭从而提高拟南芥的抗旱能力。目前关于ABA和乙烯在气孔调节上的互作机制报道的不多,鉴于蛋白激酶SnRk2.6/OST1是ABA信号重要的成份,本研究试图检验SnRk2.6/OST1作为ABA信号和乙烯信号的一个交叉点的可能性,看OST1能否与乙烯信号转导途径中的一系列成分如ETR1、EBF1、EBF2、EIN2、EIN3、MKK1、MKK4、MPK6、MKK9等存在互作。通过酵母双杂交实验和双分子荧光互补实验结果表明,OST1与MKK1、MKK4、MPK6存在互作,可能参与调控干旱响应的气孔运动过程。最后,我们试图通过激酶实验来确定OST1与MKK1、MKK4、MPK6的关系,分别构建了带His标签、GST标签以及MBP标签的融合蛋白表达载体。并确定了MKK4融合蛋白诱导条件。结果显示,带GST标签的MKK4蛋白在12℃,0.3 mmol/L IPTG诱导26 h下,通过蛋白印迹在上清中检测到一定量的目的蛋白。通过大量诱导纯化获得了MKK4目的蛋白,后续激酶实验还有待进行。为了获得遗传学的证据,构建并获得了ABA和乙烯信号途径中的双突突变体植株ost1ctr1、ost1ebf1、aba2ebf1、aba2ctr1、aba2ein3来进一步研究ABA信号和乙烯信号的互作机制。目前气孔表型分析和抗旱实验正在进行。