目的：1．构建中国地区流行的B基因型HBV可复制性克隆，验证其在体内和体外的复制能力，为HBV复制相关研究及建立细胞和动物模型奠定基础。2．将具有良好复制能力的B基因型中国株HBV可复制性克隆亚克隆到腺相关病毒载体内，建立HBV慢性感染小鼠模型，同时建立A基因型HBV慢性感染小鼠模型。3．通过高压尾静脉注射的方法将逆转录病毒和非病毒shRNA表达载体导入到小鼠体内，比较其抗HBV的时效，以期获得较长期的HBV抑制效果。方法：1．以一例中国HBV B基因型感染患者来源的全基因克隆为母板，使用SapⅠ将HBV基因组切下后在体外自身环化。使用环化后的基因组为模板分两段分别扩增HBV1.3倍基因组片段，依次将其连接到克隆载体pBluescriptⅡKS(+)上获得含HBV1.3基因组的克隆。通过转染Huh7细胞系和高压尾静脉注射BAL B／cJ小鼠建立体外和体内HBV复制模型，采用ELISA、Southern Blot、Northern Blot以及免疫组织化学染色等方法检测HBV抗原分泌、复制中间体、转录子、抗原肝细胞内表达等情况，评价构建克隆的复制能力。2．将复制能力良好的HBV1.3倍基因组亚克隆到腺相关病毒载体pAAV-MCS内构建pAAV-HBV1.3质粒，体外转染Huh7细胞，检测其复制能力。采用高压尾静脉注射的方式将pAAV-HBV1.3克隆导入到C57 BL／6小鼠肝脏内，定期采血、取肝组织标本通过ELISA、Southern Blot、RT-PCR以及免疫组织化学染色等方法检测HBV抗原分泌、抗体产生、复制中间体、转录子、抗原肝细胞内表达等情况。同时使用Huang LR等报导的pAAV-HBV1.2克隆高压注射以建立A基因型的慢性感染小鼠模型。3．根据所构建的B基因型HBV可复制性克隆X区序列设计RNAi靶点，构建shRNA表达逆转录病毒载体，同pAAV-HBV1.3体外共转染Huh7细胞，筛选对HBV复制抑制效果较好的干扰靶点shRNA表达载体，并据此构建非病毒shRNA表达载体。将逆转录病毒及非病毒shRNA表达载体高压尾静脉注射导入小鼠肝脏，观察其抗HBV效果。结果：1．所构建的HBV1.3倍基因组克隆在Huh7细胞内和在BAL B／cJ小鼠可以正常分泌HBsAg和HBeAg，检测到复制中间体和转录子的产生。小鼠血清中可以检测到高滴度HBV DNA并随注射时间出现动态变化，小鼠肝细胞内可以检出呈胞浆型和胞膜型表达的HBcAg。2．pAAV-HBV1.3和AAV-HBV1.2两种克隆均可在C57 BL／6小鼠体内形成慢性HBV复制状态。在注射后的252天(A)／340天(QS)仍可在血清HBsAg阳性小鼠肝组织内检测到HBV复制中间体及HBV转录子的存在，肝细胞内有HBcAg表达，而HBsAg阴性的小鼠则无法检出。小鼠血清HBV DNA含量可维持在10~5-10~7 copies／mL水平，A组血清HBV DNA含量较QS组约高0.6-1.6log。但病毒血症持续时间不及QS组长，慢性化比例也低于QS组，注射24周时A组阳性率14.3％；QS组44.4％。3．非病毒shRNA表达载体干预组小鼠血清HBsAg阳性率、HBsAg含量、血清病毒滴度的有效抑制时间为1周以内。逆转录病毒shRNA表达载体干预组HBV抑制时间可持续4-6周，HBsAg阳性率在注射后前4周均保持在较低水平(18.2-27.3％)，HBsAg含量下降第2周仍可达81.0％，血清病毒滴度下降1.619-2.758log，小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数目明显减少。两组的抑制效果均随着注射时间的延长而逐渐下降。结论：1．成功构建了B基因型HBV可复制性克隆，在体内外均具有良好的复制能力。2．建立了B基因型和A基因型的HBV慢性感染小鼠模型。3．直接高压尾静脉注射逆转录病毒shRNA表达载体可以有效延长RNAi作用时间，有效抑制时间可持续至少4周。本课题的创新点：1．首次构建了同我国流行情况相符合的B基因型HBV可复制性克隆，并建立了HBV慢性感染小鼠模型。2．证实通过高压尾静脉注射方式导入逆转录病毒shRNA载体可以有效抑制HBV复制持续达4周以上。本课题研究的意义：1．构建B基因型HBV可复制性克隆为研究B基因型HBV相关病毒变异、复制能力等HBV生物学研究提供了良好的基础。2．建立的B基因型和A基因型的慢性HBV感染小鼠模型，具有易获取、制备简单、费用低廉、具有正常的机体免疫功能等优点。为研究抗病毒治疗、HBV复制机制、HBV感染慢性化机制、免疫发病机制、免疫调节等基础和应用研究提供了良好的小动物模型。3．高压尾静脉直接将逆转录病毒shRNA载体导入体内即可达到较长期抑制靶基因表达，具有无需包装病毒、安全、有效、时程长、操作简便等优点。为特定基因功能研究、导入特定外源基因至体内表达、肝脏靶向性治疗等方面研究奠定基础。