背景：胎盘是母胎界面的重要组成部分,是胚胎和母体之间充分的物质交换及营养运输的重要保障。妊娠期母体子宫内膜的蜕膜化和蜕膜功能的正常发挥对胚胎着床、妊娠的建立与维持起着至关重要的作用。滋养细胞被认为是胎盘组织的重要组成部分,母胎界面滋养细胞与母体蜕膜之间的相互作用是成功妊娠的基础。滋养细胞及蜕膜基质细胞均能够分泌趋化因子来促进滋养细胞的迁移,同时滋养细胞也能够分泌粘附分子及基质金属蛋白酶等来促进自身的迁移及侵袭。胎盘发育异常能够导致各种妊娠疾病,如胚胎发育迟滞、女性妊娠高血压、子痫(clampsia)及自然流产(spontaneous abortion)等,可能由于滋养细胞的侵袭能力受损,蜕膜基质细胞的功能紊乱,从而导致滋养细胞向母体蜕膜组织的侵袭受到影响,进而导致胚胎的氧气、血液及营养物质供应不足。调查显示,我国不孕不育发生率及自然流产率已经达到了15%。作为环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors, EEDs)中的一种,双酚A(Bisphenol A, BPA)在生活中广泛存在,例如矿泉水瓶、婴儿奶瓶、食品包装及医疗器械等,研究发现,BPA也可以在母体血液、脐带血以及羊水中检测到。环境中低浓度的BPA进入机体后可在卵泡液中富集,成年女性卵泡液中的BPA浓度是血浆的3-4倍,越来越多的证据表明,BPA与女性生殖功能损伤密切相关。BPA在体内难以降解,并具有干扰机体内源性激素的特点,使其对生殖健康的影响备受关注。有研究表明,BPA暴露可致母体窦腔卵泡数量改变,成熟卵泡和黄体数量明显减少,从而导致生殖功能损伤。动物研究已经证实了BPA具有干扰内源性激素的作用,主要表现为雌激素效应,而雌激素作为胚胎植入过程中的重要激素,其水平的偏差将导致植入紊乱、不孕和流产的发生。BPA还可以刺激NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T细胞活性,提示BPA还有可能通过改变子宫内膜免疫微环境,破坏胚胎植入,影响胚胎正常发育。但是,BPA对人妊娠早期蜕膜基质细胞和胚胎滋养细胞功能的影响及相关机制尚不清楚。目的：探索BPA对母胎界面滋养细胞侵袭功能的影响及其调控机制,为女性生殖相关疾病的预防和治疗提供新的策略和思路。方法：1.总体设计：我们首先建立小鼠流产模型,观察BPA对孕鼠胚胎着床的影响,计算着床胚胎数；其次,通过细胞侵袭实验观察BPA是否能在体外影响蜕膜基质细胞(Decidual Stromal Cell, DSC)对滋养细胞的招募；通过检测蜕膜基质细胞中趋化因子的表达情况,明确BPA是否通过抑制蜕膜基质细胞中趋化因子的表达从而抑制其对滋养细胞的招募；通过检测信号通路相关分子的活化情况推测BPA是通过哪条信号通路影响蜕膜基质细胞的功能；使用ERK的抑制剂U0126来确定ERK在BPA影响蜕膜基质细胞表达趋化因子中的作用,再通过侵袭实验进一步验证ERK在蜕膜基质细胞对滋养细胞的招募中的作用；使用G15及ICI182,780来阻断GPR30及ERα/β,确定BPA是否通过GPR30及ERα/β来抑制蜕膜基质细胞中趋化因子的表达,再通过侵袭实验验证BPA是否通过GPR30及ERα/β来影响蜕膜基质细胞对滋养细胞的招募。另外,通过Transwell细胞侵袭实验及细胞划痕实验来验证BPA是否能够直接影响绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo的侵袭及迁移；最后检测BPA对HTR-8/SVneo细胞内粘附分子、基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶的组织抑制剂的表达的影响。2.BPA对孕鼠胚胎着床的影响将8周大ICR雌鼠雄鼠合笼,于每天早晨8:00-9:00检查雌鼠阴道栓,检栓阳性记为孕0.5天,将孕鼠随机分为DMSO对照组和BPA实验组,于每天早晨8:00-9:00分别以DMSO和BPA灌胃至孕5.5天。在孕5.5天时,尾静脉注射给与小鼠台盼蓝,处死小鼠并取子宫,统计胚胎着床数。3.BPA对蜕膜基质细胞招募滋养细胞的影响BPA处理蜕膜基质细胞72小时后,更换新鲜DMEM完全培养基,向预先铺有基质胶的Transwell 小室加入原代滋养细胞或者滋养细胞系HTR8/SVneo,共培养24小时,经结晶紫染色后用正置显微镜观察小室中侵袭的滋养细胞并进行计数。4.BPA对蜕膜基质细胞趋化因子表达的影响使用Real Time-PCR及酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测BPA处理后,蜕膜基质细胞表达的趋化因子IL-6, CXCL6, CXCL8和CCL11的表达情况。5.BPA影响蜕膜基质细胞招募滋养细胞的通路研究使用Western blotting方法分别检测BPA处理蜕膜基质细胞后,信号分子JNK, AKT, ERK, p38的磷酸化水平。用ERK特异性的阻断剂U0126来确认ERK在BPA抑制蜕膜基质细胞表达趋化因子CXCL8中的作用,并通过侵袭实验进一步验证ERK参与了BPA抑制蜕膜基质细胞对滋养细胞招募的过程。分别使用G15及ICI182,780来阻断GPR30及ERα/β通路,确定GPR30及ERα/β通路是否在BPA抑制蜕膜基质细胞表达趋化因子方面发挥作用；通过侵袭实验进一步验证BPA是否通过GPR30及ERα/β通路影响蜕膜基质细胞对滋养细胞的招募。6.BPA对滋养细胞侵袭及迁移的影响通过Transwell实验及细胞划痕实验来验证BPA是否能够直接影响绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo的侵袭及迁移。7.BPA对滋养细胞内蛋白表达的影响使用BPA处理绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo,通过Western blotting检测HTR-8/SVneo细胞表达粘附分子、基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶的组织抑制剂的情况。结果：BPA可以显著抑制孕鼠的胚胎着床率。细胞侵袭实验表明BPA能够在体外影响蜕膜基质细胞对滋养细胞的招募,这一过程是通过抑制蜕膜基质细胞表达CXCL8来实现的,BPA也能够同时影响蜕膜基质细胞中IL-6, CXCL6及CCL11的表达。BPA能够显著激活蜕膜基质细胞内包括ERK, AKT和p38在内的多条信号通路。使用U0126阻断ERK激活可以恢复BPA引起的蜕膜基质细胞内CXCL8表达的下降,同时滋养细胞的招募也得以恢复。使用G15, ICI182,780分别阻断BPA与膜受体GPR30及核受体ERα/β的结合也能够阻断蜕膜基质细胞内的ERK激活,同时CXCL8的表达升高,滋养细胞的招募也得以恢复。另外,BPA还能够直接通过影响滋养细胞内粘附分子、基质金属蛋白酶及基质金属蛋白酶的组织抑制剂的表达水平来抑制滋养细胞的的侵袭及迁移。结论：在母胎界面,BPA能够通过结合蜕膜基质细胞表面的膜受体GPR30及核受体ERα/β引起细胞内信号分子ERK的磷酸化,进而抑制蜕膜基质细胞趋化因子CXCL8的表达,最终抑制蜕膜基质细胞对滋养细胞的招募。另外BPA还能够直接通过影响滋养细胞表达多种蛋白来抑制滋养细胞的侵袭及迁移能力。