细菌鞭毛马达在不同负载下的转向改变动力学研究

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自然界中,大至哺乳动物,小到细菌都能对其所在的外界环境的改变作出反应,这是生命现象的基础。而这些反应的基础是由组成这些生物的单细胞参与实现的,针对外界环境变化的信号处理过程则是由细胞内的信号网络来实现的。当代生物物理的一个重大挑战就是理解这些信号网络的工作机制。为迎接这一挑战,我们结合各种实验和理论手段去寻找一些普遍原理,来理解不同的信号网络如何作用产生复杂的细胞行为。  我们以细菌行为为例,选取大肠杆菌(Escherichia coli)为模式生物,在鞭毛马达这一水平上,通过运用激光暗场技术、分子生物学技术,以及统计物理模型来研究分子与细胞的运动行为。对鞭毛马达的运动行为的研究不仅具有基础科学上的意义,也有应用前景。细菌的运动及趋化(chemotaxis)行为是细菌致病的必要条件之一,对其深入系统的研究有助于研发新的治疗药物。对鞭毛马达的系统研究也有助于未来人造纳米马达的开发和研制。基于上述考虑,我们将从以下方面展开本论文的研究内容:通过高时间和空间分辨率来系统研究鞭毛马达在高、中、低不同负载情况下的转向改变运动行为。  第一章中我们介绍了大肠杆菌的基本情况和相关背景研究,并对大肠杆菌细胞内趋化信号传导网络、鞭毛马达以及大肠杆菌的运动性等基本生物物理图像进行了简单的回顾和阐释。此外,绪论部分还就鞭毛马达的研究进展作了简要介绍,并重点分析了研究鞭毛马达的过程中可能存在的问题及可能的解决办法。  第二章中我们研究了大肠杆菌鞭毛马达在极低负载情况下的转向改变动力学过程。  首先,我们设计搭建了激光暗场实验装置。其次,我们运用分子生物学技术对大肠杆菌菌种进行改造,使其符合实验需要。这里我们构建了菌种JY33,其包含质粒pACYC184-Iq,该质粒可以表达LacIq,而LacIq可使引物isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)精确调控受促进子Ptrc控制的细胞内趋化信号分子CheY的表达;以及另外一种菌种HCB901,其包含质粒pACYC184-Iq,该菌种在引物IPTG调控下会精确表达受促进子Ptrc调控的CheY13DK106YW(一种不需磷酸化激活的变异CheY分子)。同时我们对鞭毛马达的输出端鞭毛钩和标记物纳米金球(直径150nm)的表面(nano-gold sphere)进行生化处理,使纳米金球能特异性结合鞭毛马达的输出端。最后,我们运用激光暗场实验装置来观测标记纳米金球的鞭毛马达的运动。实验发现鞭毛马达存在两种状态,顺时针转动CW(Clockwise)和逆时针转动CCW(Counterclockwise),而鞭毛马达则在这两种态之间进行转换,也即马达转换过程,我们发现鞭毛马达的CCW时间间隔分布与CW时间间隔分布服从指数分布,这与平衡态泊松双态过程模型、共构Monod-Wyman-Changeux模型或更进一步的构象传递模型是一致的。  第三章我们研究了大肠杆菌鞭毛马达在中高负载情况下的转向改变动力学过程。  首先,我们构建了包括质粒pBES38的菌种HCB901,质粒pBES38在引物IPTG的调节下可表达FliCst和LacIq,FliCst会使细胞长出粘性鞭毛。其次,我们对细菌进行鞭毛剪切处理,然后将直径1μm或0.5μm的乳胶小球标记到剪短后的细菌鞭毛上。最后,我们运用明场显微实验装置来观察标记乳胶小球的鞭毛马达的运动。我们发现在中高负载情况下鞭毛马达的CW和CCW时间间隔分布在0~0.5秒区间存在一个峰,是一种非指数分布形式的分布,这揭示了鞭毛马达在不同的负载下其运动动力学具有差别。我们又进一步发现在中高负载情况下,如果调节细胞的质子驱动力pmf(proton motive force)水平至低水平,则鞭毛马达的CW和CCW时间间隔分布满足指数分布,我们初步认为可能是马达的力矩导致马达的CW和CCW时间间隔分布具有差异。为验证该推测,我们又进行了马达的复苏实验,发现马达的时间间隔分布随马达力矩的提高逐步由指数分布变成具有峰的非指数分布,针对上述情况,我们以构象传递模型为基础,进行了大量的理论模拟,通过调节相关参数,我们得到同实验结果很好吻合的非指数分布和指数分布的模拟结果,相关的参数选择可以很好的同实验结合起来,从而支持了我们关于马达力矩是引起马达转向改变时间间隔分布出现差异的原因这一推测。
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